研究目的:腫瘤的免疫抑制微環(huán)境(TIME)是影響嵌合抗原受體(CAR)T細胞療效(尤其是實體腫瘤)的主要問題之一[1]。程序性死亡-1(PD-1;CD279)是一種位于細胞表面的I型跨膜受體,同時也是T細胞、B細胞、NK細胞、樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞甚至活化的血管內(nèi)皮細胞上表達最廣泛的T細胞抑制受體[2]。PD-1通路在所有免疫抑制信號通路上似乎是一個“主開關”,因為在某些情況下,單一劑量的抗PD治療可以使得腫瘤微環(huán)境從最初的高度抑制狀態(tài)變?yōu)楦叨然钴S的炎癥部位[3]。許多癌癥類型過度表達PD-L1,通過PD-1/PD-L1/2相互作用損害T細胞的抗腫瘤反應以逃避免疫系統(tǒng)的攻擊[4]。但是PD1-PDL1通路對于維持正常的外周免疫耐受也非常重要,如果直接靶向PDL1可能會引起非常嚴重的脫靶效應。如何通過CAR的結構改造使得CAR T細胞以調(diào)節(jié)CAR對于不同靶點的親和力,使得CAR T細胞既可以避免PD1的免疫抑制信號,又不至于產(chǎn)生脫靶是一個非常有價值的研究的課題。研究內(nèi)容和方法:我們將PD1的部分片段插入到針對CD19的二代CAR的結構中,制備靶向CD19和PDL1的新型的雙親和力...

【文章頁數(shù)】：125 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
第一章 CART細胞的制備
    1.1 實驗材料
        1.1.1 健康供者的PBMC
        1.1.2 慢病毒
        1.1.3 實驗試劑
        1.1.4 實驗儀器
    1.2 實驗方法
        1.2.1 CAR的結構示意圖
        1.2.2 CAR結構的序列
        1.2.3 慢病毒載體示意圖
        1.2.4 分選PBMC細胞
        1.2.5 分選CD3⁺T細胞
        1.2.6 轉染CAR的慢病毒
        1.2.7 CAR T細胞的表達效率的檢測
    1.3 實驗結果
    1.4 結果討論
第二章 CART的體外功能實驗
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細胞系
        2.1.2 實驗試劑
        2.1.3 實驗儀器
        2.1.4 實驗耗材
    2.2 實驗方法
        2.2.1 檢測腫瘤細胞系CD19和PDL1的表達
        2.2.2 制備表達CD19和PDL1的細胞系
        2.2.3 CART細胞對表達CD19+/-和或PDL1+/-靶細胞殺傷效率的檢測
        2.2.4 CAR T細胞對786o和786o-CD19 細胞的殺傷(顯微鏡觀察結果)
        2.2.5 CART細胞和腫瘤細胞孵育24h之后,培養(yǎng)液上清細胞因子的檢測(ELAS檢測法)
        2.2.6 CAR T細胞和腫瘤細胞孵育之后的細胞因子的檢測(LEGNplex TM human panel多因子試劑盒檢測法)
        2.2.7 CAR T細胞和對CD19 蛋白親和力的檢測
        2.2.8 CART細胞的特異性增殖
        2.2.9 CAR T細胞的表型檢測
        2.2.10 CAR T 細胞和 NALM-6 細胞孵育之后的抑制 marker 表達
        2.2.11 CAR T 細胞和 NALM-6-PDL1 孵育之后的 CAR T 細胞的轉錄組分析
        2.2.12 CAR T 細胞的線粒體壓力檢測
        2.2.13 CAR T 細胞的糖酵解速率檢測
        2.2.14 統(tǒng)計學方法
    2.3 實驗結果
        2.3.1 腫瘤細胞系 CD19 和/或 PDL1 的表達情況
        2.3.2 CAR T細胞對于CD19-PDL1-和CD19+PDL1-細胞的殺傷效率
        2.3.3 CAR T細胞對于CD19+PDL1+細胞的殺傷效率
        2.3.4 CAR T細胞對于CD19-PDL1+細胞的殺傷效率
        2.3.5 CART細胞對于K562, K562-PDL1, NALM-6-PDL1 和NALM-6-PDL1 細胞的殺傷效率
        2.3.6 PD1-BAT1,2細胞的特異性增殖
        2.3.7 PD1-BAT3細胞的特異性增殖
        2.3.8 倒置顯微鏡下CART細胞對腫瘤細胞的殺傷效果
        2.3.9 熒光顯微鏡下CART細胞對腫瘤細胞的殺傷效果
        2.3.10 CAR T細胞IFN-γ,TNF-α和 IL-2 的分泌量的檢測
        2.3.11 CAR T細胞IFN-γ,IL-21,TNF-α,IL-10,IL-2和IL-6 的分泌量的檢測
        2.3.12 CAR T細胞對于CD19 蛋白的親和力
        2.3.13 CART細胞在培養(yǎng)過程中的增殖情況
        2.3.14 CART的分化表型檢測
        2.3.15 PD1-BAT2/3CART細胞分別和NALM-6 細胞孵育24 小時后其免疫抑制marker的差異檢測
        2.3.16 2G-T 和 PD1-BAT2 代謝和分化的轉錄組的差異
        2.3.17 2G-T 和 PD1-BAT3 代謝和分化的轉錄組的差異
        2.3.18 殘余腫瘤細胞的檢測
        2.3.19 PD1-BAT3 的有氧代謝速率比2G-T細胞更高
        2.3.20 PD1-BAT3 細胞和2G-T細胞的ECAR速率類似
    2.4 結果討論
        2.4.1 不同結構的CART細胞具有不同的靶向性
        2.4.2 鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)的長度影響CART細胞的功能
        2.4.3 CART細胞對靶蛋白的親和力影響其功能
        2.4.4 PD1-BAT2/3 和腫瘤細胞孵育后其抑制分子的marker表達量比經(jīng)典二代CART細胞的表達量更低
        2.4.5 PD1-BAT2/3CART細胞的代謝模式和分化表型預示著更好的抗腫瘤活性
        2.4.6 T細胞的代謝類型和其分化表型有密切的關系
        2.4.7 改變代謝的類型來增強T細胞的功能
        2.4.8 優(yōu)化CAR的結構促進其抗腫瘤的能力
        2.4.9 通過轉染特定類型的T細胞以提高CART細胞的安全性和有效性
        2.4.10 改變CAR T細胞的微環(huán)境來增強CAR T細胞的功能
        2.4.11 CART治療腫瘤過程中不良反應的討論
第三章 CART細胞的動物實驗
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗所用小鼠和細胞
        3.1.2 實驗試劑,耗材和儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 PD1-BAT2 細胞回輸給NSG負瘤NALM-6-PDL1 的小鼠模型
        3.2.2 PD1-BAT3 細胞回輸給NSG負瘤NALM-6-PDL1 的小鼠模型
        3.2.3 統(tǒng)計學方法
    3.3 實驗結果
        3.3.1 回輸不同的CART細胞之后對NSG小鼠的腫瘤負荷的活體成像
        3.3.2 回輸不同的CAR T細胞之后對NSG小鼠的腫瘤負荷的熒光強度變化
        3.3.3 小鼠的生存曲線的統(tǒng)計
        3.3.4 PD1-BAT1組NSG小鼠會出現(xiàn)輻射樣不良反應
        3.3.5 回輸不同CAR T細胞之后NSG小鼠的腫瘤負荷的活體成像
        3.3.6 小鼠的腫瘤負荷的變化
        3.3.7 小鼠的生存曲線
        3.3.8 小鼠體內(nèi)的細胞因子(IFN-γ和 IL2)變化情況
    3.4 結果討論
第四章 探索CAR的結構和CAR T細胞功能的關系
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗試劑和耗材
        4.1.2 實驗儀器
    4.2 實驗方法:CART的構建及功能驗證
    4.3 實驗結果
        4.3.1 CART細胞的體外殺傷結果
        4.3.2 CART細胞的細胞因子分泌量
        4.3.3 在NALM-6 的高腫瘤負荷的NSG小鼠中,不同結構的CART細胞對于腫瘤負荷的控制
        4.3.4 流式檢測小鼠不同臟器的腫瘤負荷
        4.3.5 在NALM-6 的低腫瘤負荷的NSG小鼠中,不同結構的CART細胞對于腫瘤負荷的控制
    4.4 結果討論
第五章 結論和展望
參考文獻
附錄 A 不同CAR的核苷酸序列
附錄 B 綜述 改進CAR-T細胞有效性和安全性的設計策略
作者在學期間取得的學術成果
主要簡歷
致謝



本文編號：3745832