發(fā)布時(shí)間：2023-02-19 07:55

　　研究目的:腫瘤的免疫抑制微環(huán)境(TIME)是影響嵌合抗原受體(CAR)T細(xì)胞療效(尤其是實(shí)體腫瘤)的主要問(wèn)題之一[1]。程序性死亡-1(PD-1;CD279)是一種位于細(xì)胞表面的I型跨膜受體,同時(shí)也是T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞甚至活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)最廣泛的T細(xì)胞抑制受體[2]。PD-1通路在所有免疫抑制信號(hào)通路上似乎是一個(gè)“主開(kāi)關(guān)”,因?yàn)樵谀承┣闆r下,單一劑量的抗PD治療可以使得腫瘤微環(huán)境從最初的高度抑制狀態(tài)變?yōu)楦叨然钴S的炎癥部位[3]。許多癌癥類(lèi)型過(guò)度表達(dá)PD-L1,通過(guò)PD-1/PD-L1/2相互作用損害T細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)以逃避免疫系統(tǒng)的攻擊[4]。但是PD1-PDL1通路對(duì)于維持正常的外周免疫耐受也非常重要,如果直接靶向PDL1可能會(huì)引起非常嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)。如何通過(guò)CAR的結(jié)構(gòu)改造使得CAR T細(xì)胞以調(diào)節(jié)CAR對(duì)于不同靶點(diǎn)的親和力,使得CAR T細(xì)胞既可以避免PD1的免疫抑制信號(hào),又不至于產(chǎn)生脫靶是一個(gè)非常有價(jià)值的研究的課題。研究?jī)?nèi)容和方法:我們將PD1的部分片段插入到針對(duì)CD19的二代CAR的結(jié)構(gòu)中,制備靶向CD19和PDL1的新型的雙親和力...

【文章頁(yè)數(shù)】：125 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
第一章 CART細(xì)胞的制備
    1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1.1 健康供者的PBMC
        1.1.2 慢病毒
        1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器
    1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        1.2.1 CAR的結(jié)構(gòu)示意圖
        1.2.2 CAR結(jié)構(gòu)的序列
        1.2.3 慢病毒載體示意圖
        1.2.4 分選PBMC細(xì)胞
        1.2.5 分選CD3⁺T細(xì)胞
        1.2.6 轉(zhuǎn)染CAR的慢病毒
        1.2.7 CAR T細(xì)胞的表達(dá)效率的檢測(cè)
    1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    1.4 結(jié)果討論
第二章 CART的體外功能實(shí)驗(yàn)
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 細(xì)胞系
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)耗材
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 檢測(cè)腫瘤細(xì)胞系CD19和PDL1的表達(dá)
        2.2.2 制備表達(dá)CD19和PDL1的細(xì)胞系
        2.2.3 CART細(xì)胞對(duì)表達(dá)CD19+/-和或PDL1+/-靶細(xì)胞殺傷效率的檢測(cè)
        2.2.4 CAR T細(xì)胞對(duì)786o和786o-CD19 細(xì)胞的殺傷(顯微鏡觀察結(jié)果)
        2.2.5 CART細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞孵育24h之后,培養(yǎng)液上清細(xì)胞因子的檢測(cè)(ELAS檢測(cè)法)
        2.2.6 CAR T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞孵育之后的細(xì)胞因子的檢測(cè)(LEGNplex TM human panel多因子試劑盒檢測(cè)法)
        2.2.7 CAR T細(xì)胞和對(duì)CD19 蛋白親和力的檢測(cè)
        2.2.8 CART細(xì)胞的特異性增殖
        2.2.9 CAR T細(xì)胞的表型檢測(cè)
        2.2.10 CAR T 細(xì)胞和 NALM-6 細(xì)胞孵育之后的抑制 marker 表達(dá)
        2.2.11 CAR T 細(xì)胞和 NALM-6-PDL1 孵育之后的 CAR T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析
        2.2.12 CAR T 細(xì)胞的線粒體壓力檢測(cè)
        2.2.13 CAR T 細(xì)胞的糖酵解速率檢測(cè)
        2.2.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 腫瘤細(xì)胞系 CD19 和/或 PDL1 的表達(dá)情況
        2.3.2 CAR T細(xì)胞對(duì)于CD19-PDL1-和CD19+PDL1-細(xì)胞的殺傷效率
        2.3.3 CAR T細(xì)胞對(duì)于CD19+PDL1+細(xì)胞的殺傷效率
        2.3.4 CAR T細(xì)胞對(duì)于CD19-PDL1+細(xì)胞的殺傷效率
        2.3.5 CART細(xì)胞對(duì)于K562, K562-PDL1, NALM-6-PDL1 和NALM-6-PDL1 細(xì)胞的殺傷效率
        2.3.6 PD1-BAT1,2細(xì)胞的特異性增殖
        2.3.7 PD1-BAT3細(xì)胞的特異性增殖
        2.3.8 倒置顯微鏡下CART細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果
        2.3.9 熒光顯微鏡下CART細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果
        2.3.10 CAR T細(xì)胞IFN-γ,TNF-α和 IL-2 的分泌量的檢測(cè)
        2.3.11 CAR T細(xì)胞IFN-γ,IL-21,TNF-α,IL-10,IL-2和IL-6 的分泌量的檢測(cè)
        2.3.12 CAR T細(xì)胞對(duì)于CD19 蛋白的親和力
        2.3.13 CART細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中的增殖情況
        2.3.14 CART的分化表型檢測(cè)
        2.3.15 PD1-BAT2/3CART細(xì)胞分別和NALM-6 細(xì)胞孵育24 小時(shí)后其免疫抑制marker的差異檢測(cè)
        2.3.16 2G-T 和 PD1-BAT2 代謝和分化的轉(zhuǎn)錄組的差異
        2.3.17 2G-T 和 PD1-BAT3 代謝和分化的轉(zhuǎn)錄組的差異
        2.3.18 殘余腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)
        2.3.19 PD1-BAT3 的有氧代謝速率比2G-T細(xì)胞更高
        2.3.20 PD1-BAT3 細(xì)胞和2G-T細(xì)胞的ECAR速率類(lèi)似
    2.4 結(jié)果討論
        2.4.1 不同結(jié)構(gòu)的CART細(xì)胞具有不同的靶向性
        2.4.2 鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)的長(zhǎng)度影響CART細(xì)胞的功能
        2.4.3 CART細(xì)胞對(duì)靶蛋白的親和力影響其功能
        2.4.4 PD1-BAT2/3 和腫瘤細(xì)胞孵育后其抑制分子的marker表達(dá)量比經(jīng)典二代CART細(xì)胞的表達(dá)量更低
        2.4.5 PD1-BAT2/3CART細(xì)胞的代謝模式和分化表型預(yù)示著更好的抗腫瘤活性
        2.4.6 T細(xì)胞的代謝類(lèi)型和其分化表型有密切的關(guān)系
        2.4.7 改變代謝的類(lèi)型來(lái)增強(qiáng)T細(xì)胞的功能
        2.4.8 優(yōu)化CAR的結(jié)構(gòu)促進(jìn)其抗腫瘤的能力
        2.4.9 通過(guò)轉(zhuǎn)染特定類(lèi)型的T細(xì)胞以提高CART細(xì)胞的安全性和有效性
        2.4.10 改變CAR T細(xì)胞的微環(huán)境來(lái)增強(qiáng)CAR T細(xì)胞的功能
        2.4.11 CART治療腫瘤過(guò)程中不良反應(yīng)的討論
第三章 CART細(xì)胞的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)所用小鼠和細(xì)胞
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑,耗材和儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 PD1-BAT2 細(xì)胞回輸給NSG負(fù)瘤NALM-6-PDL1 的小鼠模型
        3.2.2 PD1-BAT3 細(xì)胞回輸給NSG負(fù)瘤NALM-6-PDL1 的小鼠模型
        3.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 回輸不同的CART細(xì)胞之后對(duì)NSG小鼠的腫瘤負(fù)荷的活體成像
        3.3.2 回輸不同的CAR T細(xì)胞之后對(duì)NSG小鼠的腫瘤負(fù)荷的熒光強(qiáng)度變化
        3.3.3 小鼠的生存曲線的統(tǒng)計(jì)
        3.3.4 PD1-BAT1組NSG小鼠會(huì)出現(xiàn)輻射樣不良反應(yīng)
        3.3.5 回輸不同CAR T細(xì)胞之后NSG小鼠的腫瘤負(fù)荷的活體成像
        3.3.6 小鼠的腫瘤負(fù)荷的變化
        3.3.7 小鼠的生存曲線
        3.3.8 小鼠體內(nèi)的細(xì)胞因子(IFN-γ和 IL2)變化情況
    3.4 結(jié)果討論
第四章 探索CAR的結(jié)構(gòu)和CAR T細(xì)胞功能的關(guān)系
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和耗材
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法:CART的構(gòu)建及功能驗(yàn)證
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 CART細(xì)胞的體外殺傷結(jié)果
        4.3.2 CART細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌量
        4.3.3 在NALM-6 的高腫瘤負(fù)荷的NSG小鼠中,不同結(jié)構(gòu)的CART細(xì)胞對(duì)于腫瘤負(fù)荷的控制
        4.3.4 流式檢測(cè)小鼠不同臟器的腫瘤負(fù)荷
        4.3.5 在NALM-6 的低腫瘤負(fù)荷的NSG小鼠中,不同結(jié)構(gòu)的CART細(xì)胞對(duì)于腫瘤負(fù)荷的控制
    4.4 結(jié)果討論
第五章 結(jié)論和展望
參考文獻(xiàn)
附錄 A 不同CAR的核苷酸序列
附錄 B 綜述 改進(jìn)CAR-T細(xì)胞有效性和安全性的設(shè)計(jì)策略
作者在學(xué)期間取得的學(xué)術(shù)成果
主要簡(jiǎn)歷
致謝



本文編號(hào)：3745832