研究背景和目的環(huán)狀RNA在多種腫瘤中存在異常表達(dá),然而環(huán)狀RNA在腫瘤中的功能和機(jī)制大部分仍然是未知的。本課題闡明一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA circITGA7在人結(jié)直腸癌中的表達(dá)、功能及分子機(jī)制,并初步探索其表達(dá)調(diào)控機(jī)制。研究方法通過(guò)PCR擴(kuò)增、Sanger測(cè)序、RNA酶R消化及放線菌素D處理等方法對(duì)circITGA7進(jìn)行鑒定。應(yīng)用熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)circITGA7在結(jié)直腸癌組織及結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá),分析circITGA7表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。通過(guò)上調(diào)或干擾circITGA7在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá),應(yīng)用MTT、平板克隆形成、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕愈合、Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)、裸鼠皮下瘤模型、脾臟注射肝轉(zhuǎn)移模型及盲腸原位種植轉(zhuǎn)移模型等觀察circITGA7對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)外生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的影響。通過(guò)RNA-seq及western blot篩選circITGA7調(diào)控的腫瘤相關(guān)信號(hào)通路。利用熒光原位雜交(FISH)及RNA核漿分離技術(shù)明確circITGA7在細(xì)胞內(nèi)的定位。應(yīng)用生物信息學(xué)、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、western blot及免疫組織化學(xué)(IHC)等實(shí)驗(yàn)研究...

【文章頁(yè)數(shù)】：129 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
第一章 CircITGA7的鑒定及在結(jié)直腸癌中的表達(dá)
    一、材料及方法
        1. 材料
        2. 方法
    二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        1. CircITGA7是ITGA7第4外顯子通過(guò)背向剪切形成的環(huán)狀RNA
        2. RNA酶R消化及放線菌素D處理驗(yàn)證circITGA7的穩(wěn)定性
        3. CircITGA7在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)降低
        4. CircITGA7在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)具有潛在的診斷價(jià)值
        5. CircITGA7在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系
        6. CircITGA7在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中表達(dá)降低
    三、結(jié)論
    四、討論
第二章 CircITGA7對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的影響
    一、材料及方法
        1. 材料
        2. 方法
    二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        1. CircITGA7過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證
        2. CircITGA7過(guò)表達(dá)慢病毒的制備及穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的篩選
        3. CircITGA7過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞體外增殖及遷移的影響
        4. CircITGA7過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的影響
        5. CircITGA7干擾片段的篩選及驗(yàn)證
        6. CircITGA7干擾慢病毒的制備及穩(wěn)定干擾細(xì)胞株的篩選及驗(yàn)證
        7. 干擾circITGA7表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移的影響
    三、結(jié)論
    四、討論
第三章 CircITGA7調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的機(jī)制
    一、材料及方法
        1. 材料
        2. 方法
    二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        1. RNA-seq及KEGG富集分析篩選circITGA7調(diào)控的信號(hào)通路
        2. Western blot驗(yàn)證circITGA7對(duì)Ras信號(hào)通路的調(diào)控
        3. FISH及RNA核漿分離技術(shù)檢測(cè)circITGA7的亞細(xì)胞分布
        4. CircITGA7通過(guò)結(jié)合miRNA-370-3p上調(diào)NF1表達(dá)從而抑制Ras通路
        5. CircITGA7與蛋白結(jié)合的初步探索
    三、結(jié)論
    四、討論
第四章 CircITGA7表達(dá)的上游調(diào)控機(jī)制的初步研究
    一、材料及方法
        1. 材料
        2. 方法
    二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        1. ITGA7在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)
        2. ITGA7基因的突變分析
        3. ITGA7啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)
        4. 轉(zhuǎn)錄因子RREB1對(duì)ITGA7及circITGA7表達(dá)的影響
        5. CircITGA7上下游內(nèi)含子序列對(duì)circITGA7表達(dá)的影響
    三、結(jié)論
    四、討論
全文討論
參考文獻(xiàn)
英文縮寫詞注解
攻讀博士學(xué)位期間成果
致謝



本文編號(hào)：3745581