研究背景和目的環(huán)狀RNA在多種腫瘤中存在異常表達(dá),然而環(huán)狀RNA在腫瘤中的功能和機(jī)制大部分仍然是未知的。本課題闡明一個新發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA circITGA7在人結(jié)直腸癌中的表達(dá)、功能及分子機(jī)制,并初步探索其表達(dá)調(diào)控機(jī)制。研究方法通過PCR擴(kuò)增、Sanger測序、RNA酶R消化及放線菌素D處理等方法對circITGA7進(jìn)行鑒定。應(yīng)用熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測circITGA7在結(jié)直腸癌組織及結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá),分析circITGA7表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。通過上調(diào)或干擾circITGA7在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá),應(yīng)用MTT、平板克隆形成、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕愈合、Transwell遷移及侵襲實驗、裸鼠皮下瘤模型、脾臟注射肝轉(zhuǎn)移模型及盲腸原位種植轉(zhuǎn)移模型等觀察circITGA7對結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)外生長及轉(zhuǎn)移的影響。通過RNA-seq及western blot篩選circITGA7調(diào)控的腫瘤相關(guān)信號通路。利用熒光原位雜交(FISH)及RNA核漿分離技術(shù)明確circITGA7在細(xì)胞內(nèi)的定位。應(yīng)用生物信息學(xué)、雙熒光素酶報告實驗、western blot及免疫組織化學(xué)(IHC)等實驗研究...

【文章頁數(shù)】：129 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
第一章 CircITGA7的鑒定及在結(jié)直腸癌中的表達(dá)
    一、材料及方法
        1. 材料
        2. 方法
    二、實驗結(jié)果
        1. CircITGA7是ITGA7第4外顯子通過背向剪切形成的環(huán)狀RNA
        2. RNA酶R消化及放線菌素D處理驗證circITGA7的穩(wěn)定性
        3. CircITGA7在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)降低
        4. CircITGA7在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)具有潛在的診斷價值
        5. CircITGA7在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系
        6. CircITGA7在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中表達(dá)降低
    三、結(jié)論
    四、討論
第二章 CircITGA7對結(jié)直腸癌細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移的影響
    一、材料及方法
        1. 材料
        2. 方法
    二、實驗結(jié)果
        1. CircITGA7過表達(dá)載體的構(gòu)建及驗證
        2. CircITGA7過表達(dá)慢病毒的制備及穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株的篩選
        3. CircITGA7過表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞體外增殖及遷移的影響
        4. CircITGA7過表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)生長及轉(zhuǎn)移的影響
        5. CircITGA7干擾片段的篩選及驗證
        6. CircITGA7干擾慢病毒的制備及穩(wěn)定干擾細(xì)胞株的篩選及驗證
        7. 干擾circITGA7表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞生長及遷移的影響
    三、結(jié)論
    四、討論
第三章 CircITGA7調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移的機(jī)制
    一、材料及方法
        1. 材料
        2. 方法
    二、實驗結(jié)果
        1. RNA-seq及KEGG富集分析篩選circITGA7調(diào)控的信號通路
        2. Western blot驗證circITGA7對Ras信號通路的調(diào)控
        3. FISH及RNA核漿分離技術(shù)檢測circITGA7的亞細(xì)胞分布
        4. CircITGA7通過結(jié)合miRNA-370-3p上調(diào)NF1表達(dá)從而抑制Ras通路
        5. CircITGA7與蛋白結(jié)合的初步探索
    三、結(jié)論
    四、討論
第四章 CircITGA7表達(dá)的上游調(diào)控機(jī)制的初步研究
    一、材料及方法
        1. 材料
        2. 方法
    二、實驗結(jié)果
        1. ITGA7在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)
        2. ITGA7基因的突變分析
        3. ITGA7啟動子區(qū)甲基化檢測
        4. 轉(zhuǎn)錄因子RREB1對ITGA7及circITGA7表達(dá)的影響
        5. CircITGA7上下游內(nèi)含子序列對circITGA7表達(dá)的影響
    三、結(jié)論
    四、討論
全文討論
參考文獻(xiàn)
英文縮寫詞注解
攻讀博士學(xué)位期間成果
致謝



本文編號：3745581