葉酸(folate)隸屬于B族維生素,是一碳代謝的關(guān)鍵組分。葉酸與DNA甲基化、DNA合成的保真性及損傷修復(fù)息息相關(guān)。葉酸缺乏對(duì)上述DNA正常代謝活動(dòng)具有脅迫作用,從而提高多種遺傳-環(huán)境相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn),包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Gadd45α是一種DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞生長阻滯蛋白,在特定環(huán)境脅迫和DNA損傷后表達(dá)量可顯著增加,并誘發(fā)細(xì)胞周期阻滯和凋亡。前期研究提示miRNAs可響應(yīng)葉酸缺乏并調(diào)控靶基因的表達(dá),影響一系列生物學(xué)過程。本文圍繞(1)葉酸缺乏下人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT-116遷移能力和Gadd45α表達(dá)的改變;(2)miR-5002-5p對(duì)Gadd45α的靶向調(diào)控及其介導(dǎo)的細(xì)胞遷移能力的變化開展研究。旨在為特定miRNA響應(yīng)葉酸缺乏后對(duì)靶基因表達(dá)及相關(guān)生物學(xué)過程的影響提供進(jìn)一步的科學(xué)證據(jù)。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對(duì)基因組穩(wěn)定性維護(hù)的葉酸濃度界定,以氧化型葉酸(folic acid,FA)缺乏濃度(22.6 nmol/L)和充足濃度(2260 nmol/L)分別干預(yù)培養(yǎng)HCT-116細(xì)胞;根據(jù)FA缺乏對(duì)Gadd45α表達(dá)影響以及分別轉(zhuǎn)染特異小干擾RNA(siGadd45α)和miR-5002-5p...

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略詞簡表
第1章 前言
    1.1 葉酸與基因組穩(wěn)定性、腫瘤發(fā)生和抗腫瘤研究
    1.2 miRNAs響應(yīng)葉酸缺乏及其對(duì)靶基因的調(diào)控
    1.3 Gadd45α對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡、自噬及侵襲轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控
第2章 實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)用試劑
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株
        2.1.2 主要儀器設(shè)備與試劑
        2.1.3 主要化學(xué)試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟
        2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù)
            2.2.1.1 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)
            2.2.1.2 細(xì)胞干預(yù)培養(yǎng)
            2.2.1.3 siGadd45α和 miR-5002-5p模擬物分別轉(zhuǎn)染HCT-116 細(xì)胞
        2.2.2細(xì)胞遷移能力檢測實(shí)驗(yàn)
            2.2.2.1 Transwell實(shí)驗(yàn)
            2.2.2.2劃痕實(shí)驗(yàn)
        2.2.3 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)
            2.2.3.1 miRNA和 m RNA的提取
            2.2.3.2 miRNA反轉(zhuǎn)錄
            2.2.3.3 miR-5002-5p表達(dá)量的測定
            2.2.3.4 mRNA的反轉(zhuǎn)錄
            2.2.3.5 Gadd45α和 E-cadherin轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量的測定
        2.2.4 Western Blot實(shí)驗(yàn)
            2.2.4.1 試劑配置(見附錄A)
            2.2.4.2 細(xì)胞總蛋白提取
            2.2.4.3 Gadd45α翻譯水平表達(dá)量的測定
        2.2.5載體構(gòu)建和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)
            2.2.5.1 Gadd45α3’UTR野生型質(zhì)粒構(gòu)建
            2.2.5.2 Gadd45α3’UTR突變型質(zhì)粒構(gòu)建
            2.2.5.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-5002-5p與 Gadd45α的靶向性
            2.2.5.4 雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果檢測與分析
第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 FA缺乏抑制HCT-116細(xì)胞的遷移能力
    3.2 Gadd45α響應(yīng)FA缺乏抑制HCT-116 細(xì)胞遷移能力
        3.2.1 FA缺乏誘導(dǎo)HCT-116 細(xì)胞Gadd45α表達(dá)
        3.2.2 沉默Gadd45α表達(dá)促進(jìn)HCT-116 細(xì)胞的遷移能力
    3.3 Gadd45α響應(yīng)FA缺乏的分子機(jī)制
        3.3.1 靶向調(diào)控Gadd45α的 miRNAs預(yù)測
        3.3.2 Gadd45α3’UTR野生型質(zhì)粒構(gòu)建
        3.3.3 Gadd45α3’UTR突變型質(zhì)粒構(gòu)建
        3.3.4 雙熒光素酶驗(yàn)證miR-5002-5p與 Gadd45α的靶向性
        3.3.5 FA缺乏通過抑制miR-5002-5p上調(diào)Gadd45α
    3.4 miR-5002-5p響應(yīng)FA缺乏并抑制HCT-116 細(xì)胞遷移能力的可能機(jī)制初探
第4章 討論
第5章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄 A 自配試劑和溶液配方
附錄 B 序列信息
攻讀學(xué)位期間完成的學(xué)術(shù)論文和研究成果
致謝



本文編號(hào)：3742901