自噬是真核細(xì)胞的一個(gè)保守過(guò)程,可以將細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、脂質(zhì)體或者損傷線粒體、核糖體、細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至溶酶體中進(jìn)行降解。c-Myc作為一種原癌基因在促進(jìn)多種惡性腫瘤生長(zhǎng)方面發(fā)揮重要作用。c-Myc可以通過(guò)靶向多種與代謝相關(guān)的基因進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的代謝。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）是一類(lèi)由配體結(jié)合并激活的核激素受體,同時(shí)也具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。在這里,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PPARγ包含一個(gè)LIR結(jié)構(gòu)域（LC3相互作用區(qū)域）,該結(jié)構(gòu)域可以介導(dǎo)c-Myc選擇性自噬降解且不依賴(lài)于PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性。在這個(gè)過(guò)程中,PPARγ與LC3B相互作用并且將c-Myc轉(zhuǎn)移至自噬溶酶體中從而導(dǎo)致其在溶酶體中降解。此外,PPARγ介導(dǎo)的c-Myc自噬降解可以抑制腫瘤生長(zhǎng)。本課題的結(jié)果如下:1、Western blot分析表明PPARγ過(guò)表達(dá)后能降低c-Myc蛋白水平且不影響基因的轉(zhuǎn)錄。此外PPARγ降低c-Myc蛋白水平獨(dú)立于PPARγ轉(zhuǎn)錄活性。相反,在PPARγshRNA沉默SW480細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)這個(gè)過(guò)程被逆轉(zhuǎn)。2、Western blot分析證實(shí)PPARγ能通過(guò)溶酶體途徑降解c-Myc而不是蛋白酶... 

【文章頁(yè)數(shù)】：77 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ
        1.1.1 PPARγ
        1.1.2 PPARγ和腫瘤
    1.2 c-Myc
        1.2.1 c-Myc概論
        1.2.2 c-Myc與腫瘤細(xì)胞代謝
    1.3 腫瘤與自噬
        1.3.1 自噬
        1.3.2 自噬和腫瘤代謝
    1.4 本研究的意義
    1.5 主要研究?jī)?nèi)容和技術(shù)路線
        1.5.1 主要研究?jī)?nèi)容
        1.5.2 技術(shù)路線
第二章 PPARγ誘導(dǎo)c-Myc自噬降解
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞以及質(zhì)粒
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及實(shí)驗(yàn)耗材
        2.1.3 所需實(shí)驗(yàn)試劑以及配制方法
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.2 質(zhì)粒擴(kuò)增及提取
        2.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        2.2.4 細(xì)胞總蛋白提取
        2.2.5 細(xì)胞總蛋白的濃度測(cè)定
        2.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)目的蛋白含量變化
        2.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)PPARγ核定位序列以及DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失后對(duì)其自身轉(zhuǎn)錄活性的影響
        2.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PPARγ對(duì)c-Myc基因水平的影響
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 PPARγ減少c-Myc蛋白水平獨(dú)立于PPARγ轉(zhuǎn)錄活力
        2.3.2 PPARγ介導(dǎo)的c-Myc自噬降解
    2.4 本章小結(jié)
第三章 PPARγ與c-Myc相互作用
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞以及質(zhì)粒
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及其試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.2 質(zhì)粒擴(kuò)增及提取
        3.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.2.4 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
        3.2.5 免疫熒光實(shí)驗(yàn)
        3.2.6 細(xì)胞總蛋白提取
        3.2.7 細(xì)胞總蛋白的濃度測(cè)定
        3.2.8 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)目的蛋白含量變化
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 PPARγ與內(nèi)源性c-Myc存在相互作用
    3.4 本章小結(jié)
第四章 PPARγ的LIR結(jié)構(gòu)域是誘導(dǎo)c-Myc降解的關(guān)鍵
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞以及質(zhì)粒
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        4.2.2 質(zhì)粒擴(kuò)增及提取
        4.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        4.2.4 BL21菌種感受態(tài)的制備
        4.2.5 GST純化蛋白
        4.2.6 GST pull-down
        4.2.7 免疫熒光實(shí)驗(yàn)
        4.2.8 細(xì)胞總蛋白提取
        4.2.9 細(xì)胞總蛋白濃度測(cè)定
        4.2.10 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)目的蛋白含量變化
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 PPARγ與LC3B存在相互作用
        4.3.2 PPARγ/F70是PPARγ誘導(dǎo)c-Myc自噬降解的關(guān)鍵位點(diǎn)
    4.4 本章小結(jié)
第五章 PPARγ/c-Myc通路抑制腫瘤生長(zhǎng)
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞以及質(zhì)粒
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及其試劑
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系
        5.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)
        5.2.3 軟瓊脂克隆集落形成實(shí)驗(yàn)
        5.2.4 準(zhǔn)備裸鼠
        5.2.5 擴(kuò)大培養(yǎng)
        5.2.6 構(gòu)建異植瘤裸鼠模型
        5.2.7 取腫瘤
        5.2.8 腫瘤組織總蛋白提取
        5.2.9 腫瘤細(xì)胞總蛋白濃度測(cè)定
        5.2.10 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)目的蛋白含量變化
        5.2.11 葡萄糖消耗的檢測(cè)
        5.2.12 乳酸鹽釋放的檢測(cè)
    5.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.4.1 PPARγ/F70位點(diǎn)是抑制腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵位點(diǎn)
        5.4.2 PPARγ誘導(dǎo)c-Myc自噬降解影響腫瘤細(xì)胞的葡萄糖攝取
    5.5 本章小結(jié)
第六章 總結(jié)
    6.1 PPARγ誘導(dǎo)c-Myc自噬降解
    6.2 PPARγ與c-Myc相互作用
    6.3 PPARγ中的LC3相互作用域是誘導(dǎo)c-Myc降解的關(guān)鍵
    6.4 PPARγ/c-Myc通路抑制腫瘤生長(zhǎng)
參考文獻(xiàn)
致謝
在讀期間的學(xué)術(shù)成果



本文編號(hào)：3722585