目的:胃癌是我國最常見的惡性腫瘤,在我國其發(fā)病率和死亡率居各類腫瘤的首位,因此,尋找胃癌的治療靶點(diǎn)是當(dāng)前腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。許多研究成果顯示,激酶信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程,目前已將激酶信號(hào)通路確定為腫瘤治療的靶點(diǎn),作為未來抗腫瘤藥物研發(fā)治療腫瘤的一項(xiàng)新策略。P21活化蛋白激酶1（p21-activated kinase 1,PAK1）作為I類PAK家族的代表,是進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有樞紐作用。PAK1是小G蛋白R(shí)ho家族的下游靶蛋白,可被生長因子及其他胞外信號(hào)活化,并通過與眾多的下游結(jié)合蛋白或激酶底物相互作用,調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能。PAK1除了能夠參與細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié),還參與其他生物學(xué)功能的調(diào)節(jié),如生長因子信號(hào)通路、類固醇受體通路、有絲分裂等,特別是在細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,以及腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中有重要作用,因此已成為有效的腫瘤治療靶點(diǎn)。但目前針對該靶點(diǎn)抑制劑的研究正處于起步階段。本研究旨在基于已知的PAK1空間結(jié)構(gòu),采用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法,進(jìn)行活性小分子探針設(shè)計(jì)、合成后,通過高通量篩選,獲得效能較高的PAK1小分子抑制劑。并進(jìn)一步驗(yàn)證該... 

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分：PAK1小分子抑制劑的篩選及活性驗(yàn)證
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要試劑和儀器
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 藥物配制
            2.2.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染
            2.2.3 免疫共沉淀
            2.2.4 Kinase-Glo~?Luminescent Kinase Assay
            2.2.5 提取蛋白
            2.2.6 WesternBlot
            2.2.7 激酶實(shí)驗(yàn)分析檢測藥物對激酶活性的影響
    3 結(jié)果
        3.1 體外Kinase Glo激酶發(fā)光法篩選出PAK1小分子抑制劑
        3.2 體外激酶實(shí)驗(yàn)檢測AK963/40708899對PAK1及Ⅱ類PAK家族成員PAK4和PAK6激酶活性的影響
        3.3 小分子化合物AK963/40708899可以在細(xì)胞內(nèi)抑制PAK1的激酶活性
        3.4 理化性質(zhì)比較分析結(jié)果顯示化合物AK963/40708899具有更高的成藥性,適合作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾和藥物研發(fā)
    4 討論
    5 結(jié)論
第二部分：小分子化合物AK963抑制人胃癌細(xì)胞增殖遷移及機(jī)制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要試劑和儀器
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染
            2.2.2 提取蛋白
            2.2.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染
            2.2.4 Western Blot
            2.2.5 免疫共沉淀
            2.2.6 免疫熒光及共聚焦激光掃描顯微鏡觀察
            2.2.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)
            2.2.8 RNA提取與real-time RT-PCR
            2.2.9 計(jì)算機(jī)模擬分子對接
    3 結(jié)果
        3.1 AK963抑制人胃癌細(xì)胞BGC823、SGC7901、MGC803、MKN-l的增殖
        3.2 AK963/40708899下調(diào)胃癌細(xì)胞細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinBl的表達(dá)
        3.3 化合物AK963/40708899抑制PAK1活性,通過NF-κB依賴的方式下調(diào)cyclinB1的表達(dá),從而引起G2/M細(xì)胞周期阻滯
        3.4 AK963/40708899抑制人胃癌細(xì)胞遷移和侵襲
        3.5 AK963抑制胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901絲狀偽足和促進(jìn)粘著斑復(fù)合體的形成
        3.6 AK963/40708899通過抑制PAK1-LIMKl-cofilin信號(hào)通路引起細(xì)胞骨架重排,抑制胃癌細(xì)胞遷移
        3.7 AK963/40708899通過抑制PAK1,下游以ERK依賴的方式下調(diào)FAK的激酶活性,阻礙細(xì)胞遷移
        3.8 AK963通過抑制PAK1活性下調(diào)MMP9的蛋白和上調(diào)Col4A1基因mRNA的表達(dá)
        3.9 計(jì)算機(jī)模擬分子對接顯示AK963/40708899與PAK1具有較高親和力
    4 討論
    5 結(jié)論
第三部分：小分子化合物AK963增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性及機(jī)制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要試劑和儀器
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染
            2.2.2 提取蛋白
            2.2.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染
            2.2.4 Western Blot
            2.2.5 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
    3 結(jié)果
        3.1 AK963/40708899和紫杉醇聯(lián)合用藥能更有效地抑制人胃癌細(xì)胞的增殖
            3.1.1 與單獨(dú)用藥相比,聯(lián)合用藥能更有效抑制人胃癌細(xì)胞的增殖
            3.1.2 聯(lián)合用藥能更有效實(shí)現(xiàn)胃癌細(xì)胞G2/M期阻滯
            3.1.3 聯(lián)合用藥能更有效誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡
        3.2 AK963通過PAK1依賴的方式下調(diào)微管解聚蛋白stathmin的活性,并通過影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡
    4 討論
    5 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性的自我評價(jià)
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人簡歷



本文編號(hào)：3687485