Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵作用。β-catenin與E-cadherin等蛋白形成復(fù)合體調(diào)控細(xì)胞連接和細(xì)胞骨架。同時(shí)在信號(hào)通路調(diào)控中,β-catenin可入核行使轉(zhuǎn)錄功能,從而促進(jìn)腫瘤相關(guān)基因表達(dá)。目前,β-catenin的調(diào)控,特別是蛋白穩(wěn)定性的研究較為清楚。但仍有文獻(xiàn)提示β-catenin存在非經(jīng)典的蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制。本文從一株突變細(xì)胞系中,發(fā)現(xiàn)了β-catenin存在不依賴于APC/Axin復(fù)合體的非經(jīng)典降解途徑。進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜分析互作蛋白尋找到E3泛素連接酶MARCH7。我們發(fā)現(xiàn)MARCH7與β-catenin存在互作,并且敲低MARCH7可以增加β-catenin的蛋白水平,過(guò)表達(dá)MARCH7增加了β-catenin的泛素化降解。通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù),查找到MARCH7第315位酪氨酸（Y315）存在磷酸化情況。而將其突變?yōu)楸奖彼酕后,MARCH7不能與β-catenin互作并降解β-catenin。在對(duì)此位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析后,預(yù)測(cè)出SRC酪氨酸激酶可能為MARCH7上游激酶。在突變細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn),SRC激活位點(diǎn)Y416磷酸化上調(diào),... 

【文章來(lái)源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

突變細(xì)胞系中β-catenin泛素化降解增加Figure1.2UbiquitinationdegradationwasincreasedinMUTcelllineA.β-catenintimelineexpressionafterCHXtreatmentbywesternblotwithindicated

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文42圖1.3MUT細(xì)胞系中β-catenin降解不完全依賴經(jīng)典降解磷酸化位點(diǎn)Figure1.3Degradationofβ-catenininMUTcelllinewasnotentirelydependentonclassicaldegradation-relatedphosphorylationsitesA.Non-phosphorylated（Active）β-cateninexpressionlevelunderMG132treatmentbywesternblotwithindicatedantibodies.B.β-cateninexpressionlevelunderNP-12treatmentbywesternblotwithindicatedantibodies.C.Totalphosphorylationlevelofβ-cateninbyphos-tagassay.3.1.4MUT細(xì)胞系中β-catenin降解不依賴APC/Axin復(fù)合體為驗(yàn)證MUT細(xì)胞系中β-catenin是否依賴經(jīng)典模型中的APC/Axin復(fù)合體，我們首先使用Wnt信號(hào)通路激活劑LiCl[22,23]處理細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在LiCl刺激下，WTMUT以及CL1細(xì)胞系的β-catenin均有增加，但LiCl處理組的MUT細(xì)胞系的β-catenin水平仍低于另外兩組（圖1.4A）。同時(shí)我們使用新型Wnt/β-catenin激活劑SKL2001來(lái)抑制β-catenin與APC/Axin復(fù)合體結(jié)合后，WT細(xì)胞系β-catenin蛋白水平明顯增加，而MUT細(xì)胞系β-catenin蛋白水平有增加但不如WT組明顯且未恢復(fù)至WT細(xì)胞系同水平（圖1.4B）。并且，通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)MUT細(xì)胞系中β-catenin與Axin1的相互作用能力與WT細(xì)胞系保持一致（圖1.4C）。因此，我們得出MUT細(xì)胞系中β-catenin存在非經(jīng)典降解方式。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文43圖1.4MUT細(xì)胞系中β-catenin降解不依賴APC/Axin復(fù)合體Figure1.4Degradationofβ-catenininMUTcelllineindependentofAPC/AxincomplexA.β-cateninexpresslevelunderLiCltreatmentbywesternblotwithindicatedantibodies.B.β-cateninexpresslevelunderSKL2001treatmentbywesternblotwithindicatedantibodies.C.InteractionbetweenAxin1andβ-cateninbyIPβ-catenin.3.1.5MUT細(xì)胞系中β-catenin在細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)中減少較細(xì)胞核明顯β-catenin在細(xì)胞中存在細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核[24-26]的三相分布，且各項(xiàng)分布處于動(dòng)態(tài)平衡。在外源刺激的情況下，該平衡會(huì)被打破[27]。通過(guò)細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核蛋白分離，我們發(fā)現(xiàn)在MUT細(xì)胞系中，β-catenin在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)降解均很明顯，且在細(xì)胞質(zhì)中降解更為顯著（圖1.5A）。進(jìn)一步基于激光共聚焦顯微鏡的免疫熒光實(shí)驗(yàn)可以看到，MUT細(xì)胞系的細(xì)胞骨架變化明顯，且β-catenin在細(xì)胞連接處的聚集消失。三項(xiàng)分布情況與核質(zhì)分離結(jié)果相似，即在細(xì)胞核中仍可觀察到一定量β-catenin的信號(hào)。同時(shí)，我們還觀察到MUT細(xì)胞形態(tài)較WT細(xì)胞有明顯變化。


本文編號(hào)：3629118