Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵作用。β-catenin與E-cadherin等蛋白形成復合體調(diào)控細胞連接和細胞骨架。同時在信號通路調(diào)控中,β-catenin可入核行使轉(zhuǎn)錄功能,從而促進腫瘤相關(guān)基因表達。目前,β-catenin的調(diào)控,特別是蛋白穩(wěn)定性的研究較為清楚。但仍有文獻提示β-catenin存在非經(jīng)典的蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控機制。本文從一株突變細胞系中,發(fā)現(xiàn)了β-catenin存在不依賴于APC/Axin復合體的非經(jīng)典降解途徑。進一步通過質(zhì)譜分析互作蛋白尋找到E3泛素連接酶MARCH7。我們發(fā)現(xiàn)MARCH7與β-catenin存在互作,并且敲低MARCH7可以增加β-catenin的蛋白水平,過表達MARCH7增加了β-catenin的泛素化降解。通過在線數(shù)據(jù)庫,查找到MARCH7第315位酪氨酸（Y315）存在磷酸化情況。而將其突變?yōu)楸奖彼酕后,MARCH7不能與β-catenin互作并降解β-catenin。在對此位點進行生物信息學分析后,預測出SRC酪氨酸激酶可能為MARCH7上游激酶。在突變細胞系中發(fā)現(xiàn),SRC激活位點Y416磷酸化上調(diào),... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學重慶市

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

突變細胞系中β-catenin泛素化降解增加Figure1.2UbiquitinationdegradationwasincreasedinMUTcelllineA.β-catenintimelineexpressionafterCHXtreatmentbywesternblotwithindicated

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文42圖1.3MUT細胞系中β-catenin降解不完全依賴經(jīng)典降解磷酸化位點Figure1.3Degradationofβ-catenininMUTcelllinewasnotentirelydependentonclassicaldegradation-relatedphosphorylationsitesA.Non-phosphorylated（Active）β-cateninexpressionlevelunderMG132treatmentbywesternblotwithindicatedantibodies.B.β-cateninexpressionlevelunderNP-12treatmentbywesternblotwithindicatedantibodies.C.Totalphosphorylationlevelofβ-cateninbyphos-tagassay.3.1.4MUT細胞系中β-catenin降解不依賴APC/Axin復合體為驗證MUT細胞系中β-catenin是否依賴經(jīng)典模型中的APC/Axin復合體，我們首先使用Wnt信號通路激活劑LiCl[22,23]處理細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在LiCl刺激下，WTMUT以及CL1細胞系的β-catenin均有增加，但LiCl處理組的MUT細胞系的β-catenin水平仍低于另外兩組（圖1.4A）。同時我們使用新型Wnt/β-catenin激活劑SKL2001來抑制β-catenin與APC/Axin復合體結(jié)合后，WT細胞系β-catenin蛋白水平明顯增加，而MUT細胞系β-catenin蛋白水平有增加但不如WT組明顯且未恢復至WT細胞系同水平（圖1.4B）。并且，通過免疫共沉淀實驗，我們發(fā)現(xiàn)MUT細胞系中β-catenin與Axin1的相互作用能力與WT細胞系保持一致（圖1.4C）。因此，我們得出MUT細胞系中β-catenin存在非經(jīng)典降解方式。

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文43圖1.4MUT細胞系中β-catenin降解不依賴APC/Axin復合體Figure1.4Degradationofβ-catenininMUTcelllineindependentofAPC/AxincomplexA.β-cateninexpresslevelunderLiCltreatmentbywesternblotwithindicatedantibodies.B.β-cateninexpresslevelunderSKL2001treatmentbywesternblotwithindicatedantibodies.C.InteractionbetweenAxin1andβ-cateninbyIPβ-catenin.3.1.5MUT細胞系中β-catenin在細胞膜與細胞質(zhì)中減少較細胞核明顯β-catenin在細胞中存在細胞膜，細胞質(zhì)與細胞核[24-26]的三相分布，且各項分布處于動態(tài)平衡。在外源刺激的情況下，該平衡會被打破[27]。通過細胞質(zhì)與細胞核蛋白分離，我們發(fā)現(xiàn)在MUT細胞系中，β-catenin在細胞核與細胞質(zhì)降解均很明顯，且在細胞質(zhì)中降解更為顯著（圖1.5A）。進一步基于激光共聚焦顯微鏡的免疫熒光實驗可以看到，MUT細胞系的細胞骨架變化明顯，且β-catenin在細胞連接處的聚集消失。三項分布情況與核質(zhì)分離結(jié)果相似，即在細胞核中仍可觀察到一定量β-catenin的信號。同時，我們還觀察到MUT細胞形態(tài)較WT細胞有明顯變化。


本文編號：3629118