目的:探討長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）HOTAIR在胃癌中的表達(dá)及其通過競爭性結(jié)合miR-206對胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的影響及相關(guān)作用機(jī)制。方法:實(shí)時熒光定量PCR分別檢測LncRNA HOTAIR及miR-206在胃癌組織與癌旁組織,胃癌細(xì)胞株（SGC-7901、AGS）與正常胃上皮細(xì)胞中（GES-1）的表達(dá)情況。通過構(gòu)建穩(wěn)定沉默HOTAIR表達(dá)（si-HOTAIR）及其陰性對照（si-NC）質(zhì)粒和/或過表達(dá)miR-206及其對照組（miR-206 mimics/NC）質(zhì)粒,分別對體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、AGS進(jìn)行轉(zhuǎn)染。下調(diào)HOTAIR表達(dá)和/或過表達(dá)miR-206后,通過CCK8實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)以及EDU實(shí)驗(yàn)來檢測各組細(xì)胞的增殖能力;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的遷移及侵襲能力;通過Annexin V-FITC流式細(xì)胞術(shù)來檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的凋亡率。利用生物信息學(xué)軟件在線預(yù)測HOTAIR與miR-206的可能結(jié)合位點(diǎn),然后通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證兩者結(jié)合并相互作用。通過動物實(shí)驗(yàn)觀察接... 

【文章來源】：蚌埠醫(yī)學(xué)院安徽省

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

LncRNAHOTAIR胃癌組織（A）及胃癌細(xì)胞（B）中的表達(dá)情況

2.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及構(gòu)建異常表達(dá)細(xì)胞株將小干擾RNAHOTAIR（si-HOTAIR）及陰性對照（si-NC）質(zhì)粒通過Lipofectimine2000分別轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞系SGC-7901、AGS中，構(gòu)建異常表達(dá)的細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)，應(yīng)用G418抗生素篩選出穩(wěn)定抑制表達(dá)的細(xì)胞株以及對照組。圖2.2中A和B分別代表SGC-7901、AGS細(xì)胞在鏡下的轉(zhuǎn)染si-HOTAIR質(zhì)粒效果圖，在熒光倒置顯微鏡下觀察到大量紅色熒光則代表攜帶有紅色熒光蛋白si-HOTAIR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功并可在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。因此我們可通過鏡下紅色熒光的表達(dá)情況觀察轉(zhuǎn)染效率，其后通過qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞中HOTAIR的表達(dá)量，結(jié)果如圖2.2C所示，在轉(zhuǎn)染后的SGC-7901和AGS細(xì)胞中HOTAIR的表達(dá)水平與對照組相比明顯下降（P<0.01），轉(zhuǎn)染效率達(dá)到90％以上。圖2.2轉(zhuǎn)染效果檢測A、SGC-7901轉(zhuǎn)染效果圖B、AGS轉(zhuǎn)染效果圖C、qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后HOTAIR的表達(dá)。注：**表示P<0.01。17

2.3下調(diào)HOTAIR的表達(dá)對胃癌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲及凋亡能力的影響2.3.1下調(diào)HOTAIR的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力為檢測下調(diào)LncRNAHOTAIR的表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響，首先我們通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測抑制HOTAIR表達(dá)后的對數(shù)生長期胃癌細(xì)胞（SGC-7901、AGS）分別在0h、24h、48h、72h、96h各時間點(diǎn)的增殖情況（即A450處的OD值）。如圖2.3.1-1所示，經(jīng)重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示，在兩種胃癌細(xì)胞系（SGC-7901、AGS）中，與陰性對照組相比，si-HOTAIR組細(xì)胞的OD值均顯著降低（P<0.001），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。由此可見，抑制HOTAIR的表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力，提示HOTAIR的表達(dá)與胃癌細(xì)胞增殖能力呈正相關(guān)關(guān)系。圖2.3.1-1CCK-8檢測轉(zhuǎn)染si-HOTAIR后胃癌細(xì)胞的增殖情況A、SGC-7901各時間點(diǎn)增殖情況B、AGS各時間點(diǎn)增殖情況。注：***表示P<0.001。接下來，我們通過細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測胃癌細(xì)胞的集落形成能力與增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的單個腫瘤細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)10-14天至肉眼可觀察到細(xì)胞集落形成后終止，此時計算細(xì)胞克隆形成數(shù)量。如圖2.3.1-2所示，在兩種胃癌細(xì)胞系（SGC-7901、AGS）中，與陰性對照組相比，si-HOTAIR組細(xì)胞的克隆形成數(shù)量顯著降低（P<0.01），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。18

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本文編號：3500672