目的:探討長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）HOTAIR在胃癌中的表達及其通過競爭性結合miR-206對胃癌細胞的惡性生物學行為的影響及相關作用機制。方法:實時熒光定量PCR分別檢測LncRNA HOTAIR及miR-206在胃癌組織與癌旁組織,胃癌細胞株（SGC-7901、AGS）與正常胃上皮細胞中（GES-1）的表達情況。通過構建穩(wěn)定沉默HOTAIR表達（si-HOTAIR）及其陰性對照（si-NC）質粒和/或過表達miR-206及其對照組（miR-206 mimics/NC）質粒,分別對體外培養(yǎng)的人胃癌細胞株SGC-7901、AGS進行轉染。下調HOTAIR表達和/或過表達miR-206后,通過CCK8實驗、細胞克隆形成實驗以及EDU實驗來檢測各組細胞的增殖能力;細胞劃痕實驗、Transwell侵襲實驗檢測各組細胞的遷移及侵襲能力;通過Annexin V-FITC流式細胞術來檢測轉染后各組細胞的凋亡率。利用生物信息學軟件在線預測HOTAIR與miR-206的可能結合位點,然后通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證兩者結合并相互作用。通過動物實驗觀察接... 

【文章來源】：蚌埠醫(yī)學院安徽省

【文章頁數】：71 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

LncRNAHOTAIR胃癌組織（A）及胃癌細胞（B）中的表達情況

2.2質粒轉染及構建異常表達細胞株將小干擾RNAHOTAIR（si-HOTAIR）及陰性對照（si-NC）質粒通過Lipofectimine2000分別轉染至胃癌細胞系SGC-7901、AGS中，構建異常表達的細胞株。轉染后繼續(xù)培養(yǎng)，應用G418抗生素篩選出穩(wěn)定抑制表達的細胞株以及對照組。圖2.2中A和B分別代表SGC-7901、AGS細胞在鏡下的轉染si-HOTAIR質粒效果圖，在熒光倒置顯微鏡下觀察到大量紅色熒光則代表攜帶有紅色熒光蛋白si-HOTAIR質粒轉染成功并可在細胞內進行復制。因此我們可通過鏡下紅色熒光的表達情況觀察轉染效率，其后通過qRT-PCR檢測轉染后兩組細胞中HOTAIR的表達量，結果如圖2.2C所示，在轉染后的SGC-7901和AGS細胞中HOTAIR的表達水平與對照組相比明顯下降（P<0.01），轉染效率達到90％以上。圖2.2轉染效果檢測A、SGC-7901轉染效果圖B、AGS轉染效果圖C、qRT-PCR檢測轉染后HOTAIR的表達。注：**表示P<0.01。17

2.3下調HOTAIR的表達對胃癌細胞的增殖、遷移侵襲及凋亡能力的影響2.3.1下調HOTAIR的表達抑制胃癌細胞的增殖能力為檢測下調LncRNAHOTAIR的表達對胃癌細胞增殖能力的影響，首先我們通過CCK-8實驗檢測抑制HOTAIR表達后的對數生長期胃癌細胞（SGC-7901、AGS）分別在0h、24h、48h、72h、96h各時間點的增殖情況（即A450處的OD值）。如圖2.3.1-1所示，經重復測量方差分析結果顯示，在兩種胃癌細胞系（SGC-7901、AGS）中，與陰性對照組相比，si-HOTAIR組細胞的OD值均顯著降低（P<0.001），差異具有統(tǒng)計學意義。由此可見，抑制HOTAIR的表達可抑制胃癌細胞的增殖能力，提示HOTAIR的表達與胃癌細胞增殖能力呈正相關關系。圖2.3.1-1CCK-8檢測轉染si-HOTAIR后胃癌細胞的增殖情況A、SGC-7901各時間點增殖情況B、AGS各時間點增殖情況。注：***表示P<0.001。接下來，我們通過細胞克隆形成實驗進一步檢測胃癌細胞的集落形成能力與增殖能力。將轉染后的單個腫瘤細胞連續(xù)培養(yǎng)10-14天至肉眼可觀察到細胞集落形成后終止，此時計算細胞克隆形成數量。如圖2.3.1-2所示，在兩種胃癌細胞系（SGC-7901、AGS）中，與陰性對照組相比，si-HOTAIR組細胞的克隆形成數量顯著降低（P<0.01），差異具有統(tǒng)計學意義。18

【參考文獻】：
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本文編號：3500672