目的:探究新型小分子酪氨酸激酶抑制劑DCC-2036對(duì)三陰性乳腺癌干細(xì)胞的影響及相關(guān)機(jī)制,為難治性TNBC的治療提供潛在的候選藥物。方法:1.培養(yǎng)MDA-MD-231、HS-578T細(xì)胞系并使其穩(wěn)定傳代;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)醛脫氫酶ALDH+干/祖細(xì)胞群、微球體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、Western Blot檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá),觀察DCC-2036對(duì)TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231、HS-578T的CSCs的抑制作用。2.通過(guò)Western Blot觀察DCC-2036對(duì)TNBC細(xì)胞中KLF5及其下游靶基因的抑制作用,并通過(guò)轉(zhuǎn)染KLF5質(zhì)粒探討KLF5高表達(dá)對(duì)DCC-2036抑制TNBC干細(xì)胞效果的影響,以明確KLF5是否介導(dǎo)DCC-2036對(duì)TNBC干細(xì)胞的抑制作用。通過(guò)q RT-PCR、放線菌酮（CHX）示蹤實(shí)驗(yàn)、蛋白酶體抑制劑MG132阻斷實(shí)驗(yàn)等探討DCC-2036是否通過(guò)降低KLF5的蛋白穩(wěn)定性降低KLF5的表達(dá)。通過(guò)Western Blot、q RT-PCR等實(shí)驗(yàn)觀察DCC-2036處理后AXL活性和表達(dá)及KLF5的改變,敲低/激活A(yù)XL后KLF5及其下游的表達(dá)變化,以研究DCC-20... 

【文章來(lái)源】：南華大學(xué)湖南省

【文章頁(yè)數(shù)】：83 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

DCC-2036對(duì)TNBC細(xì)胞中ALDH+干/祖細(xì)胞群表達(dá)的影響

183.1.2DCC-2036抑制TNBC干細(xì)胞的成球數(shù)目與大小通過(guò)微球體培養(yǎng)可以富集乳腺癌干細(xì)胞。為了進(jìn)一步驗(yàn)證DCC-2036對(duì)TNBC干細(xì)胞的抑制作用，我們進(jìn)行了微球體培養(yǎng)，觀察加藥處理后微球體形成的變化情況。將TNBC細(xì)胞用DCC-2036處理48小時(shí)，然后將其鋪在24孔超低附著板上。如圖1-2所示，在MDA-MB-231細(xì)胞中，對(duì)照組微球體培養(yǎng)的細(xì)胞球數(shù)為33.00±1.53，DCC-2036（5μM）干預(yù)后的細(xì)胞球數(shù)為5.00±0.88，在HS-578T細(xì)胞中，對(duì)照組微球體培養(yǎng)的細(xì)胞球數(shù)為43.00±3.28，DCC-2036（5μM）干預(yù)后的細(xì)胞球數(shù)為4.00±0.88。DCC-2036顯著減少了由兩種細(xì)胞系形成的微球體的數(shù)目和體積。差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。圖1-2DCC-2036對(duì)TNBC干細(xì)胞的微球體形成的影響注：圖A三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性圖，比例尺，100μm；圖B為統(tǒng)計(jì)圖，結(jié)果顯示為具有平均值±sd的柱狀圖，n=3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)顯著性由Student"st-test確定。***p<0.001。AB

193.1.3DCC-2036抑制TNBC干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的蛋白表達(dá)在MDA-MB-231細(xì)胞中，使用不同濃度的DCC-2036（5,10,20μM）處理48小時(shí)后，使用蛋白質(zhì)印跡法測(cè)量腫瘤干細(xì)胞（CSCs）相關(guān)標(biāo)志物的蛋白質(zhì)水平。如圖1-3所示，不同濃度的DCC-2036對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中的干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物ALDH1A1、OCT4、KLF4和SOX2的表達(dá)具有顯著的抑制作用，并且隨著DCC-2036濃度的增加，蛋白表達(dá)逐漸降低。圖1-3不同濃度的DCC-2036抑制TNBC干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的蛋白表達(dá)情況注：與對(duì)照組相比，不同濃度的DCC-2036處理后，細(xì)胞中ALDH1A1、OCT4、KLF4和SOX的蛋白表達(dá)均有明顯的差異。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)代表圖，Actin為內(nèi)參蛋白。3.2DCC-2036部分通過(guò)抑制KLF5抑制TNBC干細(xì)胞3.2.1DCC-2036抑制TNBC細(xì)胞中KLF5及其下游靶基因蛋白水平的表達(dá)文獻(xiàn)報(bào)道KLF5為基底型乳腺癌的重要干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子[21,25]，Nanog[29]和FGF-BP1[18]等都是其下游的靶基因。米非司酮通過(guò)下調(diào)KLF5抑制TNBC干細(xì)胞[21]。那么DCC-2036可否通過(guò)下調(diào)KLF5的表達(dá)而發(fā)揮抑制TNBC干細(xì)胞的作用呢？我們將MDA-MB-231、HS-578T細(xì)胞用不同濃度的DCC-2036處理48小時(shí)，

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Niclosamide,an old antihelminthic agent,demonstrates antitumor activity by blocking multiple signaling pathways of cancer stem cells[J]. Jing-Xuan Pan1,Ke Ding2 and Cheng-Yan Wang1 1 Department of Pathophysiology,Zhongshan School of Medicine,Sun Yat-sen University,Guangzhou,Guangdong 510089,P.R.China;2 Key Laboratory of Regenerative Biology and Institute of Chemical Biology,Guangzhou Institute of Biomedicine and Health,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou Science Park,Guangzhou,Guangdong 510089,P.R.China..  癌癥. 2012(04)
[2]γ-Secretase Inhibitor, DAPT Inhibits Self-renewal and Stemness Maintenance of Ovarian Cancer Stem-like Cells In Vitro[J]. Li-yu Jiang, Xiao-lei Zhang, Ping Du, Jian-hua Zheng* Department of Obstetrics and Gynecology, the First Affiliated Hospital, Harbin Medical University, Harbin 150001, China.  Chinese Journal of Cancer Research. 2011(02)



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