發(fā)布時間：2021-10-22 06:46

　　單核細胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）,簡稱單增李斯特菌,是一種革蘭氏陽性胞內(nèi)病原菌,可在多種細胞中增殖。李斯特菌感染宿主細胞后可以通過兩種不同的主要組織相容性復(fù)合體（MHC I和MHC II）途徑激活機體適應(yīng)性細胞免疫反應(yīng)。由于李斯特菌獨特的細胞內(nèi)感染機制,因此通過基因改造獲得減毒李斯特菌作為一種新型的抗原遞送活載體已廣泛用于腫瘤的免疫治療研究。我們團隊前期研究發(fā)現(xiàn),突變李斯特菌重要毒力因子溶血素LLO（由hly基因編碼）上2個關(guān)鍵氨基酸位點后細菌毒力大大降低,但仍保留了部分在細胞內(nèi)增殖能力,因此本研究主要基于LLO關(guān)鍵活性位點改造獲得減毒李斯特菌抗原遞送載體,并用于小鼠宮頸癌模型的免疫治療效果評價。本研究以單增李斯特菌參考菌株EGD-e為背景菌株,利用氨基酸突變和同源重組技術(shù)直接在李斯特菌hly基因上進行遺傳操作,獲得了減毒李斯特菌（LADS）,并通過分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)和感染生物學(xué)等手段對該毒株的生物特性和安全性開展評價。研究發(fā)現(xiàn):LADS能正常在BHI培養(yǎng)基中生長,能夠穩(wěn)定合成和分泌LLO突變蛋白,但其分泌的LLO由于關(guān)鍵活性位點突變而喪... 

【文章來源】：浙江農(nóng)林大學(xué)浙江省

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

李斯特菌感染模式圖

文獻綜述5李斯特菌還可以誘導(dǎo)腫瘤組織中的調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）減少[32,33]，Treg細胞具有維持機體免疫耐受的作用，因此降低Treg水平有利于CTL細胞的殺細胞作用。由于李斯特菌具有獨特的胞內(nèi)寄生生活，不僅能遞呈自身抗原，引起機體的強烈的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，并且能夠遞呈外源抗原，增強特異性免疫反應(yīng)，這些特征使減毒李斯特菌成為有前途的候選癌癥疫苗載體。4活細菌疫苗載體研究現(xiàn)狀一個多世紀(jì)以來，滅活或減毒細菌被用于治療癌癥取得了巨大的成功，從19世紀(jì)的Coley疫苗[33]開始，到被批準(zhǔn)的膀胱癌疫苗[34]�；诩毦囊呙缱鳛榭乖瓊鬟f載體具有一些優(yōu)勢，包括生產(chǎn)成本低，遺傳穩(wěn)定性，安全性和有效的抗腫瘤作用[35]。目前，幾種沙門氏菌，志賀氏菌，乳球菌，李斯特菌和分枝桿菌屬細菌已被用作抗癌或抗感染的疫苗載體[36,37]。迄今為止，兩種沙門氏菌血清型已被廣泛用于抗原傳遞的活載體，成為設(shè)計和開發(fā)人類疾病的新疫苗。沙門氏菌遞送的蛋白質(zhì)可以通過MHCII類分子呈遞，通常引起Th2型免疫應(yīng)答[38]。這缺少了有效的CD8+T細胞介導(dǎo)的特異性細胞免疫。為了克服這一障礙，已經(jīng)建立了幾種策略：通過基因改造使沙門氏菌可以攜圖2李斯特菌感染引起的機體免疫機制Figure2HostimmunemechanismsinresponsetoL.monocytogenesinfection

試驗研究202試驗結(jié)果2.1LADS體外生長能力不受影響通過同源重組的方法構(gòu)建李斯特減毒株，經(jīng)過抗性篩選后，將已不含抗性質(zhì)粒的菌株，提取基因組擴增對應(yīng)片段，送測序，測序結(jié)果顯示關(guān)鍵位點已經(jīng)突變?yōu)楸彼岬木昙礊槌晒?gòu)建的減毒株，將其命名為LADS，并對其進行體外生長能力檢測。如圖1.1所示，LADS在BHI中的生長能力和野生株的生長能力無顯著差異。因此，在李斯特菌hly基因上直接突變關(guān)鍵位點不會對李斯特菌體外生長造成影響。2.2LADS不影響LLO突變蛋白合成分泌由于LLO可以誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生不同的細胞因子，這些因子對于在感染宿主中產(chǎn)生獲得性免疫至關(guān)重要。因此，通過Westernblot來驗證LLO突變蛋白是否能正常合成分泌。如圖1.2所示，LADS能正常合成分泌LLO突變蛋白，說明hlyC端2個關(guān)鍵位點的突變不會對LLO蛋白合成分泌造成影響。圖1.1EGD-e，Δhly和LADS的體外生長曲線Figure1.1InvitrobacterialgrowthofEGD-e,ΔhlyandLADSstrains圖1.2Westernblot驗證LLO蛋白表達Figure1.2CytoplasmicandsecretedLLOdetectedbyWesternblot


本文編號：3450581