[目 的]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探究低氧條件下14-3-3σ蛋白對(duì)腫瘤促進(jìn)因子——低氧誘導(dǎo)因子1α（Hypoxia-inducible factor 1α,HIF1α）蛋白的調(diào)控作用并初步探求其分子機(jī)制;[方法]1.通過(guò)生物信息學(xué)分析14-3-3σ在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況及對(duì)結(jié)腸癌患者生存預(yù)后的影響,通過(guò)Western blotting驗(yàn)證14-3-3σ在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況;2.通過(guò)Western blotting方法篩選低氧下能穩(wěn)定誘導(dǎo)表達(dá)HIF1α蛋白的結(jié)腸癌細(xì)胞株;3.在篩選出的結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD1及HCT15中轉(zhuǎn)染14-3-3σ過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pCMV5-FLAG-14-3-3σ）,經(jīng)低氧刺激后通過(guò)qRT-PCR及Western blotting方法分別在mRNA及蛋白水平驗(yàn)證其對(duì)HIF1α調(diào)控作用;使用14-3-3σ的敲低質(zhì)粒（pLKO.1-shSFN）包裝成慢病毒對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1進(jìn)行感染,反向驗(yàn)證敲低14-3-3σ后對(duì)HIF1α蛋白的調(diào)控作用;4.低氧條件下在14-3-3σ過(guò)表達(dá)DLD1細(xì)胞株中使用蛋白穩(wěn)定性測(cè)定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)HIF1α蛋白穩(wěn)定性的影響;通過(guò)體外泛素化蛋白純化方法檢測(cè)... 

【文章來(lái)源】：昆明醫(yī)科大學(xué)云南省

【文章頁(yè)數(shù)】：63 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１?１４－３－３ａ在結(jié)腸癌中低表達(dá)??Ａ．?ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫(kù)中ＳＦｔＶ在結(jié)腸癌中的表達(dá)；Ｂ．?１４－３－３ａ蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞中表??

０＆ｒａｗ＝ｓｆｎ＆ｓｐｅｃｉｅｓ＝ｍＲＮＡ）。我們根據(jù)ＳｆＴＶ表達(dá)情況將患者分為“高、中、低”??三個(gè)部分，將表達(dá)量最高的前３３．３％患者定義為“ＳＦＡＡ高表達(dá)”，反之后３３．３％??患者定義為“ＳｆＴＶ低表達(dá)”。如圖１－２所示，雖然表達(dá)量差異在短期內(nèi)對(duì)患??者的生存預(yù)后并無(wú)較大影響，但隨著時(shí)間進(jìn)展ＳＦｉＶ表達(dá)量較高的ＣＲＣ患者顯示??出更好生存與預(yù)后，提示１４－３－３ａ低表達(dá)與結(jié)腸癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。??－ｎｌ＝°ｉＷ４ｓ?－ｎｈＪ？：ｓ??Ｌｏｇｒａｎｋ?ｐ－ｖａｌｕｅ＝０．１２８??ｌ?６０－?—｜??ｌ????４０－?Ｉ???２０－??〇－＊！?ｊ?ｔ?ｆ?ｊ?ｊ??０?１０００?２０００?３０００?４０００?５０００??Ｄａｙｓ??圖１－２?１４－３－３（１低表達(dá)與結(jié)腸癌患者不良預(yù)后相關(guān)??所以，本部分通過(guò)生物信息學(xué)和細(xì)胞學(xué)數(shù)據(jù)證實(shí)了?１４－３－３ＣＪ蛋白在ＣＲＣ中??呈低表達(dá)狀態(tài)，這種低表達(dá)或與其基因的表達(dá)量下降有關(guān)。且的低表達(dá)與??結(jié)腸癌患者不良預(yù)后相關(guān)，提示１４－３－３（７在ＣＲＣ的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了一定的作??用，是ＣＲＣ相關(guān)的癌癥抑制蛋白。??２?低氧可穩(wěn)定誘導(dǎo)ＤＬＤ１及ＨＣＴ１５結(jié)腸癌細(xì)胞中ＨＩＦｌａ的表達(dá)??ＨＩＦｌａ由于其本身特性，在常氧下一般不表達(dá)或表達(dá)量很少［３８１且查閱文獻(xiàn)??可知結(jié)腸癌細(xì)胞株對(duì)低氧環(huán)境的敏感性有差異，可能影響ＨＩＦｌａ的蛋白表達(dá)量。??為了更好探宄結(jié)腸癌中１４－３－３０與ＨＩＦｌａ表達(dá)之間的關(guān)系，我們使用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有??的６株貼壁培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)低氧下可穩(wěn)定表達(dá)ＨＩＦｌａ的細(xì)胞進(jìn)行了篩眩??將生長(zhǎng)至８０

感，其ＨＩＦｌａ表達(dá)在２小時(shí)內(nèi)達(dá)到峰值，我們細(xì)化了低氧暴露時(shí)間點(diǎn)，在２小??時(shí)內(nèi)測(cè)量４個(gè)時(shí)間點(diǎn)下的ＨＩＦｌａ表達(dá)量。如圖２Ｂ所示，ＤＬＤ１和ＨＣＴ１５在短時(shí)??間低氧暴露下表現(xiàn)出更明顯的積累，所以我們使用這兩株細(xì)胞在短時(shí)間的低氧暴??露條件下進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。??Ａ???ＤＬＤ１?ＨＣＴ１５??Ｈｙｐｏｘｉａ?－?１?２?４?６?８?（ｈｒ）?Ｈｙｐｏｘｉａ?－?１?２?４?６?８?（ｈｒ）??１４－３－３ａ?卜■＿?峰］２５ｋ〇ａ?１４－３－３ａ?ｌ?？?？？?一?３?２５?ｋＤａ??ＨＩＦｌａ?－?＿１００?ｋＤａ?ＨＩＦｌａ?？感?＿１〇〇?ｋＤａ??ａ－Ｔｕｂｕｌｉｎ?＾ｈｍｂｂｍｂｗｍｈ＾?■?５０?ｋＤａ?ａ－Ｔｕｂｕｌｉｎ?麵義＿．．夠．－５０?ｋＤａ??Ｂ?ＤＬＤ１?ＨＣＴ１５??Ｈｙｐｏｘｉａ?？?３０?６０?９０?１２０?（ｍｉｎ）?Ｈｙｐｏｘｉａ?－?３０?６０?９０?１２０?（ｍｉｎ）??ＨＩＦｌａ?－?ＷＢ?ｍｍ?１－１００?ｋＤａ?ＨＩＦｌａ?｜?ｉ〇〇?｜＜Ｄａ??ａ－Ｔｕｂｕｌｉｎ?■?５０?ｋＤａ?ａ－Ｔｕｂｕｌｉｎ?－?５０?ｋＤａ??圖２低氧可穩(wěn)定誘導(dǎo)ＤＬＤ１及ＨＣＴ１５細(xì)胞中ＨＩＦｌａ的表達(dá)??Ａ．長(zhǎng)期低氧刺激后ＤＬＤ１及ＨＣＴ１５細(xì)胞中ＨＩＦｌａ的表達(dá)；Ｂ．急性低氧刺激后??ＤＬＤ１及ＨＣＴ１５細(xì)胞中ＨＩＦｌａ的表達(dá)??３?１４－３－３〇在低氧下抑制ＣＲＣ細(xì)胞內(nèi)ＨＩＦｌａ表達(dá)??３．１過(guò)表達(dá)１４－３－３〇在低氧情況下抑制ＣＲＣ細(xì)胞內(nèi)ＨＩＦｌａ表達(dá)??我們使用丨４－３－３〇的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒ｐＣＭＶ５－ＦＬＡＧ－１４－３－３ｏ構(gòu)建１４－３－３ａ過(guò)表達(dá)??Ｃ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3429208