[目 的]通過體外實驗探究低氧條件下14-3-3σ蛋白對腫瘤促進因子——低氧誘導因子1α（Hypoxia-inducible factor 1α,HIF1α）蛋白的調控作用并初步探求其分子機制;[方法]1.通過生物信息學分析14-3-3σ在結腸癌中的表達情況及對結腸癌患者生存預后的影響,通過Western blotting驗證14-3-3σ在結腸癌細胞系中的表達情況;2.通過Western blotting方法篩選低氧下能穩(wěn)定誘導表達HIF1α蛋白的結腸癌細胞株;3.在篩選出的結腸癌細胞株DLD1及HCT15中轉染14-3-3σ過表達質粒（pCMV5-FLAG-14-3-3σ）,經低氧刺激后通過qRT-PCR及Western blotting方法分別在mRNA及蛋白水平驗證其對HIF1α調控作用;使用14-3-3σ的敲低質粒（pLKO.1-shSFN）包裝成慢病毒對結腸癌細胞DLD1進行感染,反向驗證敲低14-3-3σ后對HIF1α蛋白的調控作用;4.低氧條件下在14-3-3σ過表達DLD1細胞株中使用蛋白穩(wěn)定性測定實驗檢測其對HIF1α蛋白穩(wěn)定性的影響;通過體外泛素化蛋白純化方法檢測... 

【文章來源】：昆明醫(yī)科大學云南省

【文章頁數】：63 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１?１４－３－３ａ在結腸癌中低表達??Ａ．?ＴＣＧＡ數據庫中ＳＦｔＶ在結腸癌中的表達；Ｂ．?１４－３－３ａ蛋白在結腸癌細胞中表??

０＆ｒａｗ＝ｓｆｎ＆ｓｐｅｃｉｅｓ＝ｍＲＮＡ）。我們根據ＳｆＴＶ表達情況將患者分為“高、中、低”??三個部分，將表達量最高的前３３．３％患者定義為“ＳＦＡＡ高表達”，反之后３３．３％??患者定義為“ＳｆＴＶ低表達”。如圖１－２所示，雖然表達量差異在短期內對患??者的生存預后并無較大影響，但隨著時間進展ＳＦｉＶ表達量較高的ＣＲＣ患者顯示??出更好生存與預后，提示１４－３－３ａ低表達與結腸癌患者的不良預后相關。??－ｎｌ＝°ｉＷ４ｓ?－ｎｈＪ？：ｓ??Ｌｏｇｒａｎｋ?ｐ－ｖａｌｕｅ＝０．１２８??ｌ?６０－?—｜??ｌ????４０－?Ｉ???２０－??〇－＊！?ｊ?ｔ?ｆ?ｊ?ｊ??０?１０００?２０００?３０００?４０００?５０００??Ｄａｙｓ??圖１－２?１４－３－３（１低表達與結腸癌患者不良預后相關??所以，本部分通過生物信息學和細胞學數據證實了?１４－３－３ＣＪ蛋白在ＣＲＣ中??呈低表達狀態(tài)，這種低表達或與其基因的表達量下降有關。且的低表達與??結腸癌患者不良預后相關，提示１４－３－３（７在ＣＲＣ的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了一定的作??用，是ＣＲＣ相關的癌癥抑制蛋白。??２?低氧可穩(wěn)定誘導ＤＬＤ１及ＨＣＴ１５結腸癌細胞中ＨＩＦｌａ的表達??ＨＩＦｌａ由于其本身特性，在常氧下一般不表達或表達量很少［３８１且查閱文獻??可知結腸癌細胞株對低氧環(huán)境的敏感性有差異，可能影響ＨＩＦｌａ的蛋白表達量。??為了更好探宄結腸癌中１４－３－３０與ＨＩＦｌａ表達之間的關系，我們使用實驗室現有??的６株貼壁培養(yǎng)的結腸癌細胞對低氧下可穩(wěn)定表達ＨＩＦｌａ的細胞進行了篩眩??將生長至８０

感，其ＨＩＦｌａ表達在２小時內達到峰值，我們細化了低氧暴露時間點，在２小??時內測量４個時間點下的ＨＩＦｌａ表達量。如圖２Ｂ所示，ＤＬＤ１和ＨＣＴ１５在短時??間低氧暴露下表現出更明顯的積累，所以我們使用這兩株細胞在短時間的低氧暴??露條件下進行后續(xù)實驗。??Ａ???ＤＬＤ１?ＨＣＴ１５??Ｈｙｐｏｘｉａ?－?１?２?４?６?８?（ｈｒ）?Ｈｙｐｏｘｉａ?－?１?２?４?６?８?（ｈｒ）??１４－３－３ａ?卜■＿?峰］２５ｋ〇ａ?１４－３－３ａ?ｌ?？?？？?一?３?２５?ｋＤａ??ＨＩＦｌａ?－?＿１００?ｋＤａ?ＨＩＦｌａ?？感?＿１〇〇?ｋＤａ??ａ－Ｔｕｂｕｌｉｎ?＾ｈｍｂｂｍｂｗｍｈ＾?■?５０?ｋＤａ?ａ－Ｔｕｂｕｌｉｎ?麵義＿．．夠．－５０?ｋＤａ??Ｂ?ＤＬＤ１?ＨＣＴ１５??Ｈｙｐｏｘｉａ?？?３０?６０?９０?１２０?（ｍｉｎ）?Ｈｙｐｏｘｉａ?－?３０?６０?９０?１２０?（ｍｉｎ）??ＨＩＦｌａ?－?ＷＢ?ｍｍ?１－１００?ｋＤａ?ＨＩＦｌａ?｜?ｉ〇〇?｜＜Ｄａ??ａ－Ｔｕｂｕｌｉｎ?■?５０?ｋＤａ?ａ－Ｔｕｂｕｌｉｎ?－?５０?ｋＤａ??圖２低氧可穩(wěn)定誘導ＤＬＤ１及ＨＣＴ１５細胞中ＨＩＦｌａ的表達??Ａ．長期低氧刺激后ＤＬＤ１及ＨＣＴ１５細胞中ＨＩＦｌａ的表達；Ｂ．急性低氧刺激后??ＤＬＤ１及ＨＣＴ１５細胞中ＨＩＦｌａ的表達??３?１４－３－３〇在低氧下抑制ＣＲＣ細胞內ＨＩＦｌａ表達??３．１過表達１４－３－３〇在低氧情況下抑制ＣＲＣ細胞內ＨＩＦｌａ表達??我們使用丨４－３－３〇的過表達質粒ｐＣＭＶ５－ＦＬＡＧ－１４－３－３ｏ構建１４－３－３ａ過表達??Ｃ

【參考文獻】：
期刊論文
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