實驗背景:已知酪氨酸激酶受體RON的異常表達可以通過改變多種細胞功能導(dǎo)致惡性腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移。其中在基因水平上發(fā)生剪接變異是其蛋白表達異常的機制之一。本次實驗我們在結(jié)腸癌細胞系HT29細胞中發(fā)現(xiàn)了一種新的RON剪接變異體:RONA165E2。該變異體在基因水平上缺乏編碼外顯子2的mRNA,其對應(yīng)β鏈上的63個氨基酸缺失,從而產(chǎn)生了一個大小為165kda的單鏈蛋白。進一步實驗發(fā)現(xiàn)蛋白RON△165E2表達于細胞內(nèi),與巨噬細胞刺激蛋白MSP無相互作用,并且該變異體無內(nèi)在酪氨酸激酶活性。實驗?zāi)康呐c方法:通過構(gòu)建野生型及新型變異體RON質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染人胚腎上皮細胞建立蛋白表達體系;通過免疫沉淀、免疫印跡、細胞功能實驗、動物實驗等了解變異體RON△165E2蛋白的生物學(xué)特性,并為下一步研究結(jié)直腸癌靶向治療失敗患者耐藥機制提供重要的工具。實驗結(jié)果:在表達變異體RON的人胚腎上皮細胞中,我們發(fā)現(xiàn)與表達野生型蛋白的上皮細胞相比,細胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR通路存在過度激活,同時PTEN的磷酸化水平也明顯升高。另外,在多種體內(nèi)體外實驗中我們發(fā)現(xiàn)RON△165E2促進了上皮細胞的遷移、腫瘤的生長。最后... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
中文摘要
英文摘要
縮略詞表
引言
1 材料與儀器
    1.1 細胞株及質(zhì)粒
    1.2 臨床標本
    1.3 抗體及引物
    1.4 試劑及材料
    1.5 儀器及設(shè)備
2 實驗方法
    2.1 細胞培養(yǎng)
    2.2 質(zhì)粒構(gòu)建
    2.3 細胞轉(zhuǎn)染
    2.4 細胞和組織蛋白提取
    2.5 細胞和組織蛋白定量
    2.6 免疫共沉淀和免疫印跡
        2.6.1 蛋白裂解物的預(yù)清除步驟
        2.6.2 蛋白裂解物的免疫沉淀步驟
        2.6.3 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟
    2.7 RT-PCR和PCR
    2.8 細胞劃痕修復(fù)
    2.9 細胞Transwell
    2.10 細胞表面蛋白標記
    2.11 細胞免疫熒光
    2.12 動物實驗
    2.13 統(tǒng)計學(xué)方法
    2.14 溶液配置
3 實驗結(jié)果
    3.1 在人類結(jié)直腸癌細胞系中發(fā)現(xiàn)新的RON剪接變異體
    3.2 在HEK293上皮細胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達新變異體蛋白RON△165~(E2)
    3.3 變異體RON△165~(E2)蛋白表達于細胞內(nèi)
    3.4 PI3K/Akt/mTOR通路在HEK293 RON△165~(E2)細胞中持續(xù)激活
    3.5 RON△165~(E2)促進PTEN蛋白磷酸化
    3.6 RON△165~(E2)促進HEK293細胞移動
    3.7 RON△165~(E2)蛋白促進小鼠皮下腫瘤的生長
    3.8 RON△165~(E2)變異體與腫瘤臨床分期相關(guān)
4 討論
參考文獻
綜述
    參考文獻
作者簡歷及在讀期間所取得的科研成果



本文編號：3406905