本文關(guān)鍵詞：化療藥物誘導(dǎo)大腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中PrPc-STAT3通路的作用及機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的:大腸癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一。大腸癌的治療是以手術(shù)為主,并輔以化療和其他支持療法的綜合治療。大腸癌根治術(shù)后輔助化療可以降低腫瘤細(xì)胞的活性,控制、減少微小轉(zhuǎn)移灶;而術(shù)前新輔助化療可以不同程度的減輕腫瘤負(fù)荷,使臨床分期降低。因此,化療是大腸癌除手術(shù)之外最主要的治療方法。盡管化療可以有效殺滅癌細(xì)胞,但有研究表明化療還具有增加腫瘤細(xì)胞惡性表型的不良作用,化療后的腫瘤細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的侵襲性。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成具有活動(dòng)能力、能夠在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動(dòng)的間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程,它以上皮細(xì)胞極性的喪失及間質(zhì)特性的獲得為重要特征。目前已發(fā)現(xiàn)EMT存在于多種上皮來(lái)源的惡性腫瘤中,與腫瘤細(xì)胞的局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究分別通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證化療藥物與大腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT之間的關(guān)系,為進(jìn)一步研究大腸癌發(fā)生EMT過(guò)程中的分子機(jī)制提供支持。細(xì)胞型朊蛋白(cellular prion protein,PrPc)是一種新近被認(rèn)識(shí)、存在于細(xì)胞內(nèi)的正常形式朊蛋白。在前期實(shí)驗(yàn)中,同實(shí)驗(yàn)組成員發(fā)現(xiàn)PRNP(編碼PrPc的基因)是大腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT前后表達(dá)改變最明顯的基因(約21.4倍),因此在本研究中,通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)分別驗(yàn)證PrPc在大腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT的過(guò)程中是否起到了關(guān)鍵性的作用。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子(Signal transducers and activators of transcription3,STAT3)及轉(zhuǎn)錄因子Snail是眾多細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子受體信號(hào)的下游效應(yīng)物,STAT3-Snail通路的活化與多種腫瘤細(xì)胞的EMT發(fā)生有關(guān)。而本研究通過(guò)一些列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證STAT3-Snail是否參與了大腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT的過(guò)程以及是否起到了關(guān)鍵性的作用。研究方法:1.收集大腸癌患者行腸鏡活檢和新輔助化療(FOLFOX方案)后手術(shù)切除齊全配對(duì)的存檔蠟塊標(biāo)本。采用免疫組化的方法檢測(cè)新輔助化療前后標(biāo)本發(fā)生EMT的情況以及發(fā)生EMT的標(biāo)本中PrPc的表達(dá)情況。2.采用χ2及t檢驗(yàn)檢測(cè)體內(nèi)標(biāo)本發(fā)生EMT是否與患者年齡、病理類型等因素有關(guān)。3.使用化療藥物5-fu或奧沙利鉑(oxp)處理大腸癌細(xì)胞株dld-1或ht29以構(gòu)建大腸癌細(xì)胞emt模型。4.采用倒置相差顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、免疫印跡(westernblot)、體外侵襲實(shí)驗(yàn)觀察檢測(cè)細(xì)胞是否發(fā)生emt以及細(xì)胞內(nèi)stat3、細(xì)胞因子的變化情況。5.體外轉(zhuǎn)染prpcsirna或真核表達(dá)質(zhì)粒pcdna3.0-prnp或sisnail至大腸癌dld-1細(xì)胞(以空載轉(zhuǎn)染細(xì)胞為陰性對(duì)照)以干擾或促進(jìn)癌細(xì)胞內(nèi)prpc、snail的表達(dá)。6.委托上海卓康生物有限公司采用pull-down技術(shù)檢測(cè)大腸癌dld-1細(xì)胞發(fā)生emt后與prpc相結(jié)合的蛋白。7.采用免疫共沉淀方法檢測(cè)大腸癌dld-1細(xì)胞發(fā)生emt后stat3與prpc的結(jié)合情況。8.構(gòu)建e-cadherin基因啟動(dòng)子、緊密連接膜蛋白o(hù)ccluding基因啟動(dòng)子和雌激素合成酶芳香化酶(estrogensynthetaseenzymearomatase)基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因并轉(zhuǎn)染dld-1細(xì)胞,觀察啟動(dòng)子活性的變化情況。結(jié)果:1.免疫組化方法檢測(cè)臨床組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn)化療后的大腸癌細(xì)胞發(fā)生了emt且發(fā)生emt的標(biāo)本中prpc的表達(dá)量有顯著增高。2.新輔助化療后大腸癌細(xì)胞是否發(fā)生emt與癌組織微血管浸潤(rùn)及腫瘤細(xì)胞分化水平相關(guān)(p0.05),與患者年齡、性別、腫瘤病理類型無(wú)關(guān)(p0.05)。3.體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)化療藥物處理后的大腸癌細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了間質(zhì)化的改變;上皮標(biāo)記物表達(dá)水平降低而間質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)水平明顯升高;細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白f-actin發(fā)生重排;細(xì)胞體外侵襲能力增強(qiáng),表明細(xì)胞發(fā)生了emt。4.體外轉(zhuǎn)染prpcsirna干擾細(xì)胞內(nèi)prpc的表達(dá)可以顯著抑制5-fu誘導(dǎo)的emt以及抑制體外侵襲轉(zhuǎn)移力增強(qiáng)等效應(yīng)。5.體外轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒pcdna3.0-prnp使癌細(xì)胞內(nèi)直接表達(dá)prpc可以使大腸癌細(xì)胞發(fā)生emt。6.采用pull-down檢測(cè)出5-fu作用后的dld-1細(xì)胞中與prpc結(jié)合力最強(qiáng)的蛋白是stat3(92kda)。7.5-fu作用dld-1細(xì)胞12小時(shí)后,采用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)表達(dá)的prpc蛋白即可與stat3相互結(jié)合,并伴隨stat3關(guān)鍵活性位點(diǎn)tyr705和ser727磷酸化水平的提高。8.使用pcdna3.0-prnp轉(zhuǎn)染dld-1細(xì)胞后,使用westernblot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Snail被誘導(dǎo)表達(dá),但這種誘導(dǎo)作用能被AZD9150(PrPc-STAT3通路抑制劑)明顯抑制。同時(shí),其他EMT轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平則無(wú)明顯變化,未受這兩種處理因素影響。9.通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè),PrPc可以抑制上述三種啟動(dòng)子活性,該抑制過(guò)程可被AZD9150、siSnail兩種處理因素所抑制。10.抑制PrPc表達(dá)能引起5-FU作用后的DLD-1細(xì)胞核內(nèi)Snail幾乎完全消失。而在對(duì)照組細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)PrPc能促進(jìn)細(xì)胞漿內(nèi)Snail向細(xì)胞核內(nèi)移位。11.轉(zhuǎn)染pCDNA3.0-PRNP至DLD-1細(xì)胞12小時(shí)后,就能引起較明顯的Snail表達(dá)和Snail磷酸化。結(jié)論:體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明化療藥物可以誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT。大腸癌細(xì)胞在化療藥物作用下的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程依賴于PrPc蛋白的功能。PrPc通過(guò)下游STAT3通路在化療藥物誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT的過(guò)程中發(fā)揮作用。PrPc-STAT3信號(hào)通路在大腸癌發(fā)生EMT過(guò)程中,通過(guò)調(diào)控Snail磷酸化來(lái)影響E-cadherin等基因的表達(dá),繼而在EMT過(guò)程中發(fā)揮主要作用。
【關(guān)鍵詞】：大腸癌 化療 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) 細(xì)胞型朊蛋白(PrPc) 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3) 轉(zhuǎn)錄因子Snail
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.34
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 縮略詞表12-13
• 前言13-16
• 材料與方法16-26
• 第一部分：體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證化療藥物誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT的作用26-32
• （一）結(jié)果26-30
• （二）討論30-32
• 第二部分：證實(shí)PrPc在化療藥物誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程中的作用32-37
• （一） 結(jié)果32-34
• （二）討論34-37
• 第三部分：研究PrPc參與化療藥物誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞EMT的下游通路37-42
• （一） 結(jié)果37-40
• （二）討論40-42
• 全文小結(jié)42-43
• 參考文獻(xiàn)43-49
• 綜述49-63
• 參考文獻(xiàn)54-63
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況63-64
• 致謝64

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  本文關(guān)鍵詞：化療藥物誘導(dǎo)大腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中PrPc-STAT3通路的作用及機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：337273