發(fā)布時間：2021-08-12 02:50

　　乳腺癌的高發(fā)病率嚴重影響我國婦女的身心健康,而早發(fā)現并及時治療可以降低其帶來的死亡率。研究表明,基因啟動子區(qū)域是否存在被甲基化,可以成為早期篩查乳腺癌的重要生物學指標。隨著“液態(tài)活檢”技術的快速發(fā)展,發(fā)現監(jiān)測游離DNA的甲基化水平對腫瘤的早期診斷具有重要的臨床意義。因此,本文建立了一種一體化評估乳腺癌患者血清樣本中DNA甲基化的方法,為乳腺癌早期診斷提供新思路。1、針對血清樣本,優(yōu)化了一種基于磁珠法的核酸提取試劑盒,包括磁珠用量,核酸助沉劑的量等,并進行了一系列性能測試,如試劑盒的穩(wěn)定性測試和回收率測試。結果顯示,該試劑盒穩(wěn)定性好,其核酸的回收率也在90%以上。同時,其對真實樣本有著相同甚至更優(yōu)于商用柱式法試劑盒的提取效果。最后,實驗還優(yōu)化了該試劑盒的提取步驟,合并了裂解和結合步驟,大大的縮短了核酸提取時間。2、建立了一種重組酶介導鏈替換核酸擴增技術（RAA）熒光檢測SNRPN基因甲基化的新方法。實驗主要包括篩選RAA熒光檢測方法所需的引物與探針,并經過一系列優(yōu)化,包括反應時間和反應溫度,最終得到了最優(yōu)的體系。然后,通過合成了一段標準的甲基化模板,用于甲基化基因定量曲線的繪制。實驗結果... 

【文章來源】：湖南工業(yè)大學湖南省

【文章頁數】：67 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

磁珠法提取核酸的過程原理圖

碩士學位論文3在高鹽濃度與低pH值的條件下，溶液中的羥基磁珠會與核酸通過疏水作用、氫鍵作用和靜電作用等發(fā)生特異性結合，而不與其他雜質（如蛋白、糖類）結合，迅速從生物樣品中捕獲到核酸。而在低鹽濃度和高pH值的條件下，羥基磁珠會與結合的核酸分離，從而達到釋放核酸的目的。利用磁珠法提取試劑盒來純化樣本中的核酸，其最大優(yōu)點就是可以自動化。整個提取過程在有磁場條件下磁珠可以發(fā)生定向的聚集或分散，從而可減少需離心等手工操作的使用。磁珠法是也目前應用最為廣泛的一種核酸提取方法，其能實現自動化提取核酸，大大提高了工作效率。其提取流程如圖1-1所示：將血清樣本做簡單處理，然后經過裂解步驟-結合步驟-洗脫步驟，最后得到純化后的核酸。表1-1內列舉了國內外部分磁珠法提取游離DNA試劑盒的產品信息。表1-1磁珠法提取游離DNA試劑盒的產品信息Table1-1Productinformationofmagneticbeadscell-freeDNAextractionkit廠家產品名稱樣本類型樣本體積產率海貍BeaverBeadsCirculatingDNAKit血清、血漿等0.2-5mL85%ThermoFisherMagMAXCell-FreeDNA(cfDNA)Isolation血清、血漿、尿液0.5-10mL10–12ng/mL天根生化MagneticSerum/PlasmaDNAKit血漿、血清等0.4-5mL84%ANGENMagPureCirculatingDNAMaxiKit血漿、血清等2-6mL86%柱式法：圖1-2柱式法提取核酸的過程原理圖Figure1-2Schematicdiagramofnucleicacidextractionbycolumnmethod柱式法是提取游離DNA的高效方法，其可以在較低的樣本體積中獲得較高的DNA產率。目前，柱式法提取試劑盒中的離心柱主要是以硅膠濾膜作為固相載體，然后基于二氧化硅可選擇性結合核酸的獨特屬性，實現核酸的提取與純化。

DNA甲基化檢測方法的建立及其在乳腺癌血清樣本的應用12圖1-3cfMeDIP-seq方法的示意圖Figure1-3SchematicrepresentationofthecfMeDIP–seqprotocol1.4重組酶介導等溫擴增技術聚合酶鏈式反應（PCR）是一種廣泛用于專業(yè)檢測機構的核酸檢測技術，但由于這想技術操作復雜、所需儀器昂貴、涉及多重變溫過程，所以其并不適用于家庭檢測和基層檢測。因此，為了克服PCR技術的缺點，等溫擴增檢測技術引起研究者廣泛關注。近十幾年來，新型的等溫核酸擴增技術得到了飛速的發(fā)展，如環(huán)介導等溫擴增技術67、重組酶聚合酶擴增68、滾環(huán)擴增69、依賴解旋酶DNA恒溫擴增技術70等等，被廣泛應用于生產生活的各個方面，并且獲得了一定的實際應用價值。目前，一種新型的恒溫核酸擴增技術-重組酶介導等溫擴增（Recombinase-aidamplification,RAA）技術被發(fā)展71，并迅速應用于病原體檢測、食品成分分析、病毒分析，疾病分析等領域72-75。這種技術的基本原理是：首先由引物、重組酶、單鏈結合蛋白形成復合體，在引物同源的序列處會使雙鏈的靶DNA解旋，接下來單鏈結合蛋白（SSB）會與解離的單鏈DNA結合來防止單鏈DNA復性，最后在dNTP存在的情況下，由DNA聚合酶完成鏈的延伸，該擴增過程可在5-20分鐘完成76（如圖1-4所示）。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]血清游離DNA濃度及完整性在食管癌診斷中的價值[J]. 邱蘊文,申嫻娟,金春景,曹興建,鞠少卿.  中華腫瘤雜志. 2018 (12)



本文編號：3337428