[研究目的]嵌合抗原受體 T 細(xì)胞（Chimeric Antigen Receptor T Cell,CAR-T）療法是一種通過(guò)對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行基因改造來(lái)實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向殺傷的免疫治療技術(shù)。目前CAR-T細(xì)胞在治療血液系統(tǒng)腫瘤方面已經(jīng)取得了很好的療效。但是在CAR-T細(xì)胞制備的過(guò)程中CAR基因?qū)氲姆椒ㄖ饕遣《巨D(zhuǎn)染。在病毒轉(zhuǎn)染的過(guò)程中,無(wú)論是制備成本、致病性還是潛在的插入誘變可能性都在臨床應(yīng)用中存在著顯著的監(jiān)管障礙。本實(shí)驗(yàn)室自主構(gòu)建的人工抗原提呈細(xì)胞（Artificial antigen presenting cell,aAPC）能夠作為飼養(yǎng)細(xì)胞于體外特異性刺激CAR-T細(xì)胞的增殖,不僅提高了擴(kuò)增效率,還能夠減少外源細(xì)胞因子及磁珠的使用量,降低實(shí)驗(yàn)成本,可大幅減輕臨床患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。為了避免病毒轉(zhuǎn)染體系的不足之處,本實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用的CAR-T細(xì)胞是通過(guò)piggyBac轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化體系所轉(zhuǎn)染,并由aAPC于體外刺激培養(yǎng)所制備的。因此本實(shí)驗(yàn)的目的是研究轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化體系制備并由aAPC刺激增殖這一新的制備體系下生產(chǎn)的CAR-T細(xì)胞其體內(nèi)殺瘤活性及安全性。作為臨床前實(shí)驗(yàn),充分證明該培養(yǎng)體系下制備的CAR-... 

【文章來(lái)源】：昆明醫(yī)科大學(xué)云南省

【文章頁(yè)數(shù)】：88 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１?ＮＡＭＡＬＷＡ小鼠（ＳＣＩＤ）移植瘤模型處理流程??

ＣＡＲ－Ｔ細(xì)胞體內(nèi)殺瘤活性驗(yàn)證處理流程圖??腹腔注射兩次?邏制生??＾??１??＼＼???）?？?？?????????？??夭?〇?３?１０?１７?２４?３１?３２??＞ａｍ?ａｈｖａ細(xì)跑尾靜財(cái)注射??圖１－１?ＮＡＭＡＬＷＡ小鼠（ＳＣＩＤ）移植瘤模型處理流程??ＣＡＲ－Ｔ細(xì)胞體內(nèi)殺瘤活性驗(yàn)證處理流程圖??＝次?小鼠挪麵麵識(shí)■ＩＪＳＩ??ｉ?ｌ－＾Ｈ??＼＊?＾??／?？?？?？?ｍ?？?？??＾?０?３?１０?１７?２４?３２??Ｒ＞湖腿靜贓射??圖１－２?Ｒａｊｉ細(xì)胞小鼠（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）移植瘤模型處理流程??２．４實(shí)驗(yàn)方法??２．４．１常規(guī)試劑的配方??１６４０完全培養(yǎng)基（１０％血清）：ＲＰＭＩ－１６４０培養(yǎng)液，置于４°Ｃ保存，臨用前溶化??后加入１０％胎牛血清、１００Ｕ／ｍｌ青霉素和鏈霉素和０．２５ｎｇ／ｍｌ可溶性兩性霉素Ｂ。??１６４〇完全培養(yǎng)基（２０％血清）：ＲＰＭＩ－１６４０培養(yǎng)液，置于４°Ｃ保存，臨用前溶化??后入２０％胎牛血清，］００Ｕ／ｍｌ青霉素和鏈霉素，０．２５略／ｍｌ可溶性兩性霉素Ｂ。??ＰＢＳ?緩沖液：８ｇＮａＣｌ、０．２ｇＫＣｌ、１．４４ｇＮａ２ＨＰ〇４?和?０．２４ｇＫＨ２Ｐ〇４，溶于?８００ｍｌ??蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的ｐＨ值至７．４，最后加蒸餾水定容至１Ｌ。在１３４°??Ｃ（１．０３４Ｘ?ｌ〇５Ｐａ）高壓下蒸氣滅菌２０分鐘，保存存于室溫或４°Ｃ冰箱中。??流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞清洗液：ｌｇＢＳＡ溶于ｌＯＯｍｌＰＢＳ，用０．４５?ｕｍ濾網(wǎng)過(guò)濾除菌后放??置４°Ｃ冰箱中保存。??１４??

二、結(jié)果??３．１?ＮＡＭＡＬＷＡ細(xì)胞模型小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞分布情況??為了檢測(cè)ＳＣＩＤ小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的分布及數(shù)量情況，在小鼠麻醉后向其腹??腔內(nèi)注射Ｂｅｅｔｌｅ?Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ?Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ?Ｓａｌｔ甲蟲焚光素鉀鹽。向小鼠體內(nèi)注射的??ＮＡＭＡＬＷＡ細(xì)胞內(nèi)含有人工轉(zhuǎn)入的熒光素酶報(bào)告基因能夠產(chǎn)生熒光素酶蛋白，??當(dāng)其與小分子底物焚光素Ｂｅｅｔｌｅ?Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ?Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ?Ｓａｌｔ甲蟲焚光素鉀鹽結(jié)合時(shí)??在氧、Ｍｇ２＋離子存在的條件下消耗ＡＴＰ發(fā)生氧化反應(yīng)，將部分化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)榭??見光釋放，從而被ＩＶ丨Ｓ?Ｓｐｅｃｔｒｕｍ?Ｓｙｓｔｅｍ小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)記錄，通過(guò)比較不??同時(shí)間內(nèi)小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞發(fā)光情況的動(dòng)態(tài)變化，從而分析推測(cè)出小鼠體內(nèi)腫瘤??細(xì)胞的分布情況。通過(guò)小鼠活體熒光成像的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)注射進(jìn)小鼠體內(nèi)的??ＮＡＭＡＬＷＡ細(xì)胞能夠穩(wěn)定生存并不斷進(jìn)行增殖和擴(kuò)散，見圖１－３，１－４。該模型腫??瘤移植成功率達(dá)到１００％。并且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未發(fā)生腫瘤自行消退現(xiàn)象。??…。關(guān)叫??ｌｌｌｌ；??ｄ?３麵醜Ｌ??圖１－３活體熒光成像監(jiān)測(cè)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞分布情況??２０??

【參考文獻(xiàn)】：
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