本文關(guān)鍵詞：Syncytin基因異常表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建和白血病動物模型的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(human endogenous retroviruses,HERV)是生物進(jìn)化過程中遠(yuǎn)古逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人類基因組,繼而通過孟德爾遺傳方式被后代遺傳留下的遺跡。HERV至少可分為31個家族,而研究最多的是HERV-K、ERV-H、 HERV-W三個家族。其中Syncytin是HERV-W基因編碼的囊膜蛋白,由538個氨基酸組成。本研究小組在研究中發(fā)現(xiàn)在8個白血病或淋巴瘤細(xì)胞系中syncytin mRNA和syncytin蛋白均有不同程度的表達(dá),并且syncytin基因的表達(dá)水平與白血病患者病情相關(guān)。通過用密度梯度離心法分離患者及正常對照的外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),利用自制的抗體檢測白血病患者細(xì)胞膜上的表達(dá)。證實了syncytin蛋白在白血病細(xì)胞系以及部分患者外周血細(xì)胞膜有表達(dá)。白血病對人類的生命和健康造成了極大的威脅,是國內(nèi)10個高發(fā)的一類造血干細(xì)胞克隆性的惡性腫瘤,其男性的發(fā)病率高于女性,且35歲以下人群發(fā)病率的死亡率最高。從白血病的發(fā)現(xiàn)至今,我們還沒用完全清楚白血病復(fù)雜的病因與發(fā)病機(jī)制。白血病的發(fā)病主要與遺傳因素,病毒因素,染色體及免疫功能遺傳有關(guān)。20世紀(jì)70年代以來白血病實驗研究的新發(fā)展是利用免疫缺陷動物做白血病動物模型,從而研究人類白血病細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、分子機(jī)制及其生物學(xué)特性,進(jìn)而用來進(jìn)行實驗治療,尋求診斷白血病新的靶點(diǎn)。小鼠造血系統(tǒng)特點(diǎn)與人類十分相似,同時近交系動物基因純合度高,遺傳背景均一,易于控制,重復(fù)性好。因此,選擇近交系小鼠構(gòu)建syncytin基因異常表達(dá)小鼠白血病動物模型更能近似反映人體的實際情況。能夠為研究syncytin基因在白血病發(fā)生機(jī)制中所起的作用和解析syncytin基因如何參與白血病分子機(jī)理以及靶向基因治療的研究提供一個較為理想的模型。本實驗采用lipofectamine 2000 Reagent將syncytin過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到EL4細(xì)胞和293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后熒光倒置顯微鏡下觀察,只在293T細(xì)胞空載體發(fā)現(xiàn)熒光,經(jīng)Western Blot和RT-PCR檢測,過表達(dá)組Syncytin蛋白和基因相對表達(dá)量明顯高于對照組,表明過表達(dá)載體有效可用。利用Lenti-Pac HIV慢病毒包裝Syncytin表達(dá)質(zhì)粒,感染EL4細(xì)胞,用含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行陽性篩選,獲得穩(wěn)定表達(dá)syncytin的細(xì)胞株。經(jīng)Western Blot檢測,過表達(dá)syncytin細(xì)胞組的syncytin/β-Actin灰度比值明顯高于對照組；QPCR檢測穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞mRNA表達(dá)結(jié)果顯示只有過表達(dá)syncytin細(xì)胞有相對高的表達(dá)量。上述實驗揭示了穩(wěn)定表達(dá)Syncytin蛋白的syncytin-EL4細(xì)胞系構(gòu)建成功。本實驗同時用低表達(dá)syncytin的Jurkat細(xì)胞系做小鼠白血病動物模型預(yù)實驗。選用C57BL/6小鼠,供鼠為雄鼠,受鼠為雌鼠。骨髓移植前6天給與含硫酸慶大霉素(0.004ml/只)無菌水喂養(yǎng),持續(xù)至移植后2周。前7天進(jìn)行消洗寶液(0.1g/L)藥浴,前三天開始所有小鼠每天一次分別經(jīng)尾靜脈注射環(huán)磷酰胺(CTX),注射量為100mg/kg。前2天將(1-2)×106各組細(xì)胞0.5m1經(jīng)尾靜脈接種至C57BL/6小鼠。骨髓移植后觀察發(fā)現(xiàn)各組小鼠的體重情況變化均幅度不大,小鼠多運(yùn)動,精神狀態(tài)較好。兩周后小鼠尾尖取血涂片觀察,對照組(EL4細(xì)胞組)和實驗組(syncytin低表達(dá)細(xì)胞組)中的原始細(xì)胞的比例沒有顯著性的差異(P0.05)綜上所述,本實驗成功建立了穩(wěn)定表達(dá)Syncytin蛋白的syncytin-EL4細(xì)胞系,為下一步建立穩(wěn)定表達(dá)syncytin-EL4細(xì)胞系小鼠白血病動物模型和分析研究syncytin與白血病免疫逃逸機(jī)制提供了細(xì)胞模型。小鼠白血病動物模型的預(yù)實驗間接證實了低表達(dá)syncytin的Jurkat細(xì)胞系可能在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)syncytin基因不表達(dá)或缺失,猜想syncytin在低表達(dá)syncytin田胞中的表達(dá)在細(xì)胞多次傳代后受到其他基因的抑制。該動物模型的建立為后續(xù)的syncytin-EL4穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系小鼠白血病動物模型的建立提供了更明確的實驗方法,從而為揭示syncytin在小鼠白血病發(fā)生的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)的一步。
【關(guān)鍵詞】：人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒 白血病 syncytin 動物模型 骨髓移植 QPCR
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.7;R-332
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-17
• 縮略表17-18
• 第一章 緒論18-32
• 1.1 人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒18-19
• 1.2 HERVS分類19-20
• 1.3 HERV的結(jié)構(gòu)與分布20-21
• 1.4 HERV的生物學(xué)功能21-22
• 1.4.1 編碼基因的表達(dá)21
• 1.4.2 對其他基因的順勢調(diào)控作用21-22
• 1.4.3 HERV元件的相互作用22
• 1.4.4 其他作用22
• 1.5 HERV與腫瘤22-24
• 1.6 HERV-W家族24-27
• 1.6.1 HERV-W24
• 1.6.2 Syncytin與白血病24-27
• 1.7 小鼠白血病模型27-28
• 1.7.1 近交系小鼠28
• 1.7.2 突變系小鼠28
• 1.8 研究內(nèi)容28-32
• 1.8.1 穩(wěn)定表達(dá)syncytin EL4細(xì)胞系的構(gòu)建29-30
• 1.8.2 Syncytin基因異常表達(dá)小鼠動物模型的建立30-32
• 第二章 穩(wěn)定表達(dá)syncytin EL4細(xì)胞系的構(gòu)建32-70
• 2.1 實驗試劑溶液、耗材、儀器32-36
• 2.1.1 試劑溶液32-35
• 2.1.2 耗材35
• 2.1.3 儀器35-36
• 2.2 Syncytin過表達(dá)載體構(gòu)建36-43
• 2.2.1 載體的構(gòu)建36-40
• 2.2.2 STBL3菌種擴(kuò)增培養(yǎng)40
• 2.2.3 STBL3感受態(tài)細(xì)胞制作40-41
• 2.2.4 載體轉(zhuǎn)化41
• 2.2.5 轉(zhuǎn)化擴(kuò)增培養(yǎng)后單克隆挑取及擴(kuò)大培養(yǎng)41
• 2.2.6 hLUC慢病毒載體提取41-42
• 2.2.7 質(zhì)粒濃度測定及瓊脂糖凝膠電泳42-43
• 2.2.7.1 質(zhì)粒濃度測定42
• 2.2.7.2 電泳檢測42-43
• 2.2.8 結(jié)果43
• 2.2.8.1 濃度測定43
• 2.2.8.2 凝膠電泳圖43
• 2.3 載體轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、提取43-44
• 2.4 載體測序44-47
• 2.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EL4細(xì)胞47-49
• 2.5.1 EL4細(xì)胞培養(yǎng)47-48
• 2.5.2 轉(zhuǎn)染48-49
• 2.6 Western Blot檢測質(zhì)粒的有效性49-55
• 2.6.1 抗體和溶液的配置49-50
• 2.6.2 細(xì)胞總蛋白的提取與變性50
• 2.6.3 用BCA蛋白定量試劑盒測定樣品中蛋白含量50-52
• 2.6.4 制膠52-53
• 2.6.5 蛋白變性53
• 2.6.6 電泳53
• 2.6.7 轉(zhuǎn)膜53
• 2.6.8 封閉和孵育抗體53-54
• 2.6.9 顯影54
• 2.6.10 實驗結(jié)果及分析54-55
• 2.7 慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EL4后的RT-PCR檢測55-58
• 2.7.1 Trizol法提取細(xì)胞總RNA55
• 2.7.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄及總RNA濃度測定55-56
• 2.7.3 RT-PCR檢測56-57
• 2.7.4 RT-PCR結(jié)果57-58
• 2.8 篩選Syncytin-EL4穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株58-60
• 2.8.1 慢病毒包裝58-59
• 2.8.2 Syncytin慢病毒感染EL4細(xì)胞59
• 2.8.3 篩選Syncytin-EL4穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選59-60
• 2.9 WB和QPCR檢測syncytin-EL4穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞60-69
• 2.9.1 WB檢測穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞表達(dá)蛋白表達(dá)60-64
• 2.9.1.1 細(xì)胞總蛋白的提取與變性(所有的操作均要在冰上進(jìn)行)61
• 2.9.1.2 用BCA蛋白定量試劑盒測定樣品中蛋白含量61-62
• 2.9.1.3 電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育抗體及顯影62-64
• 2.9.1.4 實驗結(jié)果及分析64
• 2.9.2 PCR檢測穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞mRNA表達(dá)64-69
• 2.9.2.1 實驗中主要試劑的配制64-65
• 2.9.2.2 引物65
• 2.9.2.3 標(biāo)本的處理65
• 2.9.2.4 總RNA的提取65-66
• 2.9.2.5 RNA質(zhì)量檢測66
• 2.9.2.6 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA66-67
• 2.9.2.7 定量PCR檢測67-69
• 2.10 本章實驗小結(jié)69-70
• 第三章 Syncytin基因異常表達(dá)小鼠白血病動物模型的建立70-80
• 3.1 實驗試劑、耗材、儀器71-72
• 3.2 Syncytin基因異常表達(dá)小鼠動物模型的建立72-78
• 3.2.1 小鼠骨髓移植前處理72
• 3.2.2 小鼠骨髓移植(BMT)分組72
• 3.2.3 BMT后的觀察72-73
• 3.2.4 實驗結(jié)果與分析73-78
• 本章小結(jié)78-80
• 第四章 結(jié)論80-82
• 致謝82-84
• 參考文獻(xiàn)84-88
• 附錄A88
• 附錄B88

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本文編號：320813