【背景】結(jié)直腸癌的發(fā)病率位居我國惡性腫瘤第三位,發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢,且發(fā)病年齡逐步年輕化。在我國結(jié)直腸癌患者的5年生存率為65%,但當(dāng)早期發(fā)現(xiàn)和早期治療時,5年生存率上升到90%。當(dāng)前臨床上常見的結(jié)直腸鏡檢查難以發(fā)現(xiàn)早期癌。而且,常見結(jié)直腸癌的血清診斷標(biāo)志物CEA和CA199特異性和敏感性難以令人滿意。因此,大力加強結(jié)直腸癌基礎(chǔ)研究,篩選鑒定新的診斷結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物并闡明其影響結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的病理機制,對于建立新的防治策略,顯得尤為重要。線粒體是真核細胞重要的細胞器,在能量供應(yīng)、ROS產(chǎn)生、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細胞凋亡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。越來越多的研究證實線粒體在腫瘤的發(fā)生進展中起著非常重要的作用。線粒體參與腫瘤細胞的增值、侵襲轉(zhuǎn)移以及凋亡等多種惡性表型。腫瘤與線粒體相關(guān)研究依然成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點問題。線粒體生物發(fā)生和質(zhì)量控制通常在癌癥中上調(diào)以適應(yīng)外界環(huán)境改變。很多研究表明在腫瘤中線粒體通過線粒體發(fā)生實現(xiàn)對腫瘤惡性表型的調(diào)控。因此,線粒體發(fā)生有望成為腫瘤防治的靶點。線粒體單鏈DNA結(jié)合蛋白（mtSSB）具有促進mtDNA復(fù)制和損傷修復(fù),進而調(diào)控線粒體生成的重要作用。近年來,mtSSB... 

【文章來源】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)陜西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：108 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
縮略語表
中文摘要
英文摘要
前言
文獻回顧
第一部分 mtSSB在結(jié)直腸癌中的表達及其臨床意義
    1 材料
        1.1 研究對象
        1.2 主要試劑和耗材
        1.3 主要儀器
    2 方法
        2.1 提取樣本組織總RNA和反轉(zhuǎn)錄
        2.2 實時定量PCR反應(yīng)實驗
        2.3 組織蛋白質(zhì)的提取
        2.4 BCA蛋白定量
        2.5 Western blot實驗檢測結(jié)直腸癌組織mtSSB表達
        2.6 免疫組織化學(xué)染色實驗
        2.7 統(tǒng)計分析
    3 結(jié)果
        3.1 結(jié)直腸癌組織樣本分析mtSSB的表達差異
        3.2 mtSSB表達高低與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析
    4 討論
第二部分 mtSSB調(diào)控結(jié)直腸癌細胞生長的生物學(xué)作用研究
    1 材料
        1.1 研究對象
        1.2 主要試劑和耗材
        1.3 主要儀器
    2 方法
        2.1 細胞培養(yǎng)
        2.2 mtSSB過表達質(zhì)粒載體構(gòu)建
        2.3 shRNA干涉質(zhì)粒構(gòu)建
        2.4 CRC細胞轉(zhuǎn)染
        2.5 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞篩選
        2.6 檢測mtSSB過表達和干涉效果
        2.7 細胞計數(shù)方法檢測細胞數(shù)目
        2.8 EDU檢測細胞增殖
        2.9 克隆形成的檢測
        2.10 Western blot實驗
        2.11 裸鼠皮下成瘤實驗
        2.12 HE染色
        2.13 IHC染色
        2.14 統(tǒng)計學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 mtSSB在不同結(jié)直腸癌細胞系中表達情況
        3.2 檢測mtSSB在結(jié)直腸癌細胞中的過表達和干涉效果
        3.3 體外實驗檢測mtSSB對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響
        3.4 體內(nèi)實驗檢測mtSSB對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響
    4 討論
第三部分 mtSSB調(diào)控結(jié)直腸癌細胞生長的機制研究
    1 材料
        1.1 研究對象
        1.2 主要試劑和耗材
        1.3 主要儀器
    2 方法
        2.1 提取基因組DNA
        2.2 實時定量PCR檢測mtDNA拷貝數(shù)
        2.3 透射電鏡觀察并統(tǒng)計線粒體數(shù)目
        2.4 線粒體氧耗實驗
        2.5 ATP生成實驗
        2.6 端粒酶活性檢測
        2.7 實時定量PCR檢測端粒長度
        2.8 ROS含量檢測
    3 結(jié)果
        3.1 mtSSB對結(jié)直腸癌細胞中mtDNA拷貝數(shù)的影響
        3.2 mtSSB對結(jié)直腸癌細胞中線粒體數(shù)目的影響
        3.3 結(jié)直腸癌臨床樣本中檢測mtSSB對線粒體數(shù)目和mtDNA拷貝數(shù)的影響
        3.4 mtSSB對結(jié)直腸癌細胞線粒體氧化磷酸化功能的影響
        3.5 mtSSB對結(jié)直腸癌細胞線粒體ATP生成的影響
        3.6 mtSSB對結(jié)直腸癌細胞端粒酶活性的影響
        3.7 mtSSB對結(jié)直腸癌細胞端粒長度的影響
        3.8 mtSSB對結(jié)直腸癌細胞ROS水平的影響
        3.10 mtSSB干涉后加H2O2對結(jié)直腸癌細胞端粒酶活性和端粒長度影響
    4 討論
第四部分 調(diào)控結(jié)直腸癌細胞mtSSB表達的機制研究
    1 材料
        1.1 研究對象
        1.2 主要試劑和耗材
        1.3 主要儀器
    2 方法
        2.1 炎癥因子刺激結(jié)直腸癌細胞
        2.2 Westernblot實驗
        2.3 IHC實驗
        2.4 構(gòu)建mtSSB基因5’上游啟動子區(qū)截短體熒光素酶報告質(zhì)粒
        2.5 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗
        2.5 轉(zhuǎn)染細胞
        2.6 細胞計數(shù)實驗
        2.7 EDU細胞增殖實驗
        2.8 平板克隆實驗
    3 結(jié)果
        3.1 不同濃度的細胞因子對mtSSB表達的影響
        3.2 FOXP1直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控mtSSB的表達
        3.3 IL-6通過mtSSB調(diào)控CRC細胞的生長
        3.4 裸鼠皮下成瘤體內(nèi)實驗驗證IL-6通過mtSSB調(diào)控結(jié)直腸癌細胞的生長·
    4 討論
小結(jié)
參考文獻
個人簡歷和研究成果
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]中國結(jié)直腸癌發(fā)病趨勢分析和預(yù)測[J]. 代珍,鄭榮壽,鄒小農(nóng),張思維,曾紅梅,李霓,陳萬青.  中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志. 2012 (07)
[2]Telomere function in colorectal cancer[J]. Cristina Frías,Alberto Morán,Carmen de Juan,Paloma Ortega,Tamara Fernández-Marcelo,Andrés Sánchez-Pernaute,Antonio José Torres,Eduardo Díaz-Rubio,Manuel Benito,Pilar Iniesta.  World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2009(01)



本文編號：3194142