目的:構(gòu)建特異的靶向人C1GALT1基因的RNA干擾（RNAinterference,RNAi）慢病毒載體,建立C1GALT1基因穩(wěn)定沉默的胃癌MGC803細(xì)胞株。對慢病毒介導(dǎo)的shRNA靶向干擾C1GALT1胃癌MGC803穩(wěn)定細(xì)胞株生物學(xué)特性進(jìn)行初步觀察,檢測沉默C1GALT1基因表達(dá)對MGC803細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、周期、凋亡功能的影響。方法:1.設(shè)計(jì)C1GALT1基因的特異性shRNA靶點(diǎn),構(gòu)建pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO-h-C1GALT1干擾慢病毒包裝載體,包裝慢病毒并侵染MGC803細(xì)胞,構(gòu)建C1GALT1基因穩(wěn)定沉默的胃癌MGC803細(xì)胞株。用轉(zhuǎn)染空載體的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞作為陰性對照。采用qPCR方法檢測MGC803細(xì)胞中C1GALT1的mRNA水平變化,Western Blot方法檢測C1GALT1蛋白水平的表達(dá),以鑒定C1GALT1基因沉默的效果。2.采用CCK8增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測C1GALT1基因沉默后對胃癌MGC803細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、周期、凋亡能力的影響。結(jié)果:1.成功構(gòu)建了特異... 

【文章來源】：南華大學(xué)湖南省

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

h-C1GALT1shRNA1測序結(jié)果比對圖(綠色區(qū)域?yàn)榕c目的序列匹配部分）

17第三章實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO-h-C1GALT1重組質(zhì)粒的構(gòu)建和測序鑒定將siRNA1單鏈的引物退火，再連接入雙酶切線性化的RNA干擾載體(pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO)中，挑選菌落送至測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果正確（見圖3.1，3.2），證明構(gòu)建pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO-h-C1GALT1重組質(zhì)粒成功。圖3.1h-C1GALT1shRNA1測序結(jié)果比對圖(綠色區(qū)域?yàn)榕c目的序列匹配部分）圖3.2測序峰圖3.2pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO-h-C1GALT1慢病毒感染MGC803細(xì)胞及構(gòu)建穩(wěn)定沉默細(xì)胞系將pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO-h-C1GALT1慢病毒感染人胃癌MGC803細(xì)胞，并添加助感染試劑增加感染率，再進(jìn)行C1GALT1基因穩(wěn)定沉默的胃癌MGC803細(xì)胞的單克隆培養(yǎng)，使用Puromycin篩選感染細(xì)胞,然后對其放大培養(yǎng)，用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞呈現(xiàn)出綠色熒光，表明穩(wěn)定感染的細(xì)胞株構(gòu)建成功。

18單克隆MGC803-h-C1GALT1干擾擴(kuò)大培養(yǎng)后的熒光圖，選取1個(gè)視野進(jìn)行熒光和白光拍照，結(jié)果如下：見圖3.3。圖3.3MGC-803細(xì)胞系中沉默C1GALT1表達(dá)的細(xì)胞株（×20）3.3ReRlRRmePCR法檢測C1GALT1表達(dá)結(jié)果C1GALT1基因穩(wěn)定沉默細(xì)胞系MGC-803中經(jīng)過單克隆培養(yǎng)及篩選最終挑取MGC803-sh-C1GALT1-1、MGC803-sh-C1GALT1-2、MGC803-sh-C1GALT1-3這3株細(xì)胞，和空載體組細(xì)胞（MGC-803-NC）一共4株分別進(jìn)行RNA提取，利用紫外分光光度計(jì)其質(zhì)量，見表3.1。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)并繪制溶解曲線及擴(kuò)增曲線，GAPDH和h-C1GALT1溶解曲線較好，證明RNA抽提和QPCR過程無問題，見圖3.4、3.5。C1GALT1基因穩(wěn)定沉默組的C1GALT1的mRNA比陰性對照組明顯降低（p＜0.05），h-C1GALT1在MGC-803細(xì)胞中有干擾效果，其中C1GALT1-shRNA1單克隆3干擾下調(diào)73%，見圖3.6。表3.1紫外分光光度計(jì)檢測RNA提取質(zhì)量檢測結(jié)果樣品名稱OD260/OD280OD260/OD230RNA濃度(ng/uL)MGC-803-NC1.911.99546sh-C1GALT1-11.891.96560sh-C1GALT1-21.861.94551sh-C1GALT1-31.881.95544

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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