肝細胞癌（HCC）是全球最流行的惡性腫瘤之一,并且其高死亡率和高復發(fā)率一直是困擾臨床治療的難題。隨著對HCC發(fā)展的分子機制和治療耐藥性認識的增強,臨床研究者已經開發(fā)出許多分子靶向藥物,并成為當前抗HCC藥物研究的重點之一。這些藥物可能靶向癌癥發(fā)展中重要的一個或多個關鍵信號傳導通路,例如細胞增殖,細胞凋亡和血管生成等。銜接蛋白Gab2作為支架分子,不僅在細胞異常增殖、侵襲、遷移等病理過程中發(fā)揮重要的作用,而且在信號轉導中也扮演了重要的角色,使得其在人類癌癥的發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的作用備受關注。本實驗室過往的研究表明,Gab2在肝癌中的表達顯著高于癌旁或正常組織細胞,并且過表達Gab2的腫瘤細胞的增殖,遷移及侵襲能力常常高于相應的癌旁或正常組織細胞。肝癌細胞中Gab2的高表達現(xiàn)象是由許多因素與調控機制共同作用形成的,而microRNA的調控表現(xiàn)的至關重要,并且異常表達的microRNA作為生物標志物可以用作HCC早期診斷以及預后治療的分子靶點,因此我們對靶向調控Gab2蛋白的microRNA進行了探索。本課題利用生物信息學網(wǎng)站及軟件對可能調控Gab2的microRNA進行預測,篩選出9個mi... 

【文章來源】：廈門大學福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１．?Ｇａｂ２介導的細胞內信號傳導途徑??Ｆｉｇ．?１－１．?Ｇａｂ２－ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ?ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?ｐａｔｈｗａｙ??

然后按照試劑盒所述配置反轉錄體系，如下：??ＲＮＡ?１?ｐ，ｇ??ＳｉｐｅｒＭｉｘ?ｆｏｒ?ｑＰＣＲ?４?ｊｊ．Ｌ??ＤＮＡ?ｒｅｍｏｖｅｒ?１?｜ｊ．Ｌ??ＲＮａｓｅ－Ｗａｔｅｒ?Ｍ?２０?｜ｉＬ??超純水根據(jù)ＲＮＡ的體積調整補齊至２０?ｐＬ反應體系反復吹打混勻，再在??ＰＣＲ儀中４２?°Ｃ孵育３０分鐘，８５?°Ｃ加熱１０秒終止反應。??（２）?ｍｉＲＮＡ與普通ＲＮＡ的反轉錄有所不同。由于ｍｉＲＮＡ的長度太短，往往??小于ｑＰＣＲ引物的長度，用ｍＲＮＡ的反轉錄方法不利于引物結合并且容易引起??非特異性擴增，無法得到足以定量的ｃＤＮＡ。所以，ｍｉＲＮＡ的反轉要求將其序??列進行延長。目前常用的序列延長反轉錄法包括莖環(huán)法和ｐｏｌｙＡ加尾法兩種。其??原理如圖２－１所示。??

圖２－２．重疊延伸ＰＣＰ??Ｆｉｇ２－２．?Ｏｖｅｒｌａｐ?ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ?ＰＣＰ．??（１）引物Ｆ及Ｒ為原基因兩端特異引物，其中Ｆｍ及Ｒｍ為設計中間引物，且??引物Ｆｍ及Ｒｍ中間共享一段序列（至少１５?ｂｐ左右堿基序列完全匹配），＊為突??變點。然后分別用引物？和�。抟约埃疲砗停蚁嗷ヅ鋵M行普通ＰＣＲ擴增。此??夕卜，值得注意的是因為Ｔａｑ酶擴增容易造成產物移碼突變，ＰＣＰ擴增時最好選擇??Ｐ＆酶。??（２）回收第Ｉ步所得兩條ＰＣＲ產物??（３）將第２步所得兩份ＰＣＲ產物進行混合使其互為模板及引物，加入ｄＮＩＰ、??Ｐ＆酶及引物Ｆ和Ｒ進行普通ＰＣＲ擴增即可獲得出定點突變的產物。??Ｈｓａ－ｍｉＲ－ｌ８ｌａ的結合位點有８個連續(xù)的堿基，ｈｓａ－ｍｉＲ－９的結合位點有８個??連續(xù)的堿基和７個不連續(xù)的堿基，我們根據(jù)重疊延伸ＰＣＲ的原理來設計引物將??

【參考文獻】：
期刊論文
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