目的:從PTEN甲基化調(diào)控PI3K/Akt通路的角度,闡明HBX抑制HepG2細(xì)胞凋亡的機(jī)制,為更深入認(rèn)識(shí)HBX基因?qū)Ω伟┑纳飳W(xué)作用機(jī)制及尋找抗癌治療的藥物新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。方法:根據(jù)是否轉(zhuǎn)染HBX基因及加入5-Aza-Cd R藥物處理,將實(shí)驗(yàn)分為五組:轉(zhuǎn)染pCMV（+）-HBX質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染pCMV（+）-空質(zhì)粒組、空白組（未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒）、轉(zhuǎn)染pCMV（+）-HBX質(zhì)粒+5-Aza-CdR組、轉(zhuǎn)染pCMV（+）-空質(zhì)粒+5-Aza-CdR組。體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞,采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HBX基因,使用熒光顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率;利用流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞的凋亡水平;利用甲基化特異性PCR（MSP）方法檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞中PTEN甲基化及非甲基化水平;采用RT-PCR、Western Blot檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞中PTEN、DNMT3A和p-Akt/Akt的表達(dá)。結(jié)果:基因測(cè)序結(jié)果顯示成功構(gòu)建了過表達(dá)重組質(zhì)粒pCMV（+）-HBX。熒光顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pCMV（+）-HBX及pCMV（+）-空質(zhì)粒后,轉(zhuǎn)染效率在80%之間,可用于后... 

【文章來源】：南華大學(xué)湖南省

【文章頁數(shù)】：57 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
主要英文縮略詞索引
第1章 前言
第2章 主要實(shí)驗(yàn)材料及儀器設(shè)備
    2.1 主要實(shí)驗(yàn)材料
    2.2 主要儀器設(shè)備
    2.3 主要溶液配制
第3章 實(shí)驗(yàn)方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)分組
    3.2 細(xì)胞培養(yǎng)
    3.3 質(zhì)粒擴(kuò)增及提取
    3.4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
    3.5 普通 PCR（RT-PCR）
    3.6 甲基化特異性 PCR（MSP）
    3.7 Western Blot
    3.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡
    3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.1 過表達(dá) HBVgp3（HBX）基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建
    4.2 測(cè)序結(jié)果
    4.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后計(jì)算轉(zhuǎn)染效率
    4.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組 HepG2 細(xì)胞凋亡水平
    4.5 RT-PCR 檢測(cè)各組 HepG2 細(xì)胞中 PTEN mRNA 的表達(dá)水平
    4.6 Western Blot 檢測(cè)各組 HepG2 細(xì)胞中 PTEN 蛋白的表達(dá)水平
    4.7 MSP 檢測(cè)各組 HepG2 細(xì)胞中 PTEN 基因甲基化及非甲基化的表達(dá)水平
    4.8 Western Blot 檢測(cè)各組 HepG2 細(xì)胞中 DNMT3A 蛋白的表達(dá)水平
    4.9 Western Blot 檢測(cè)各組 HepG2 細(xì)胞中 p-Akt/Akt 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平
第5章 討論
第6章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]肝癌表觀遺傳學(xué)研究的進(jìn)展[J]. 汪文,黃衛(wèi).  國際消化病雜志. 2013(02)
[2]乙肝病毒X蛋白對(duì)不同肝細(xì)胞系凋亡的誘導(dǎo)作用[J]. 楊倩,鄧志華,賀丹丹.  中國腫瘤生物治療雜志. 2012(04)
[3]HBx-induced reactive oxygen species activates hepatocellular carcinogenesis via dysregulation of PTEN/Akt pathway[J]. Hye-Lin Ha,Dae-Yeul Yu.  World Journal of Gastroenterology. 2010(39)
[4]肝癌表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J]. 黃健.  中國科學(xué)(C輯:生命科學(xué)). 2008(10)

博士論文
[1]PTEN基因在慢性淋巴細(xì)胞白血病中的表達(dá)及其調(diào)控研究[D]. 鄒志建.南京醫(yī)科大學(xué) 2014



本文編號(hào)：2922092