發(fā)布時(shí)間：2020-12-01 20:28

　　目的:黑色素瘤是一種常見的、惡性度極高的皮膚惡性腫瘤,具有高侵襲性、高死亡率和高免疫原性等特點(diǎn)。臨床上用于治療黑色素瘤的易普利姆瑪在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中,50%的患者出現(xiàn)了不良反應(yīng),部分更因出現(xiàn)嚴(yán)重的胰腺炎而被迫終止用藥。納武單抗也只有在輔助手術(shù)切除治療時(shí)才具有較長的無復(fù)發(fā)生存期。因此找到一種更有效的治療惡性黑色素瘤的方法刻不容緩。5-azacytidine（Aza）已被FDA批準(zhǔn)用于治療骨髓增生異常綜合征,低劑量的Aza能通過去甲基化作用使機(jī)體內(nèi)沉默的ERVs表達(dá)出來,從而通過病毒防御途徑激活免疫。Toll樣受體是連接固有免疫和獲得性免疫的橋梁,Toll樣受體7（TLR7）激動劑能夠有效激活免疫從而發(fā)揮對抗腫瘤的作用。本研究的目的包括:（1）合成新型的TLR7小分子激動劑;（2）探索將此TLR7激動劑與經(jīng)Aza處理后的黑色素瘤細(xì)胞相偶聯(lián)制備全細(xì)胞腫瘤疫苗的方法;（3）驗(yàn)證所制備的腫瘤疫苗于小鼠體內(nèi)的抗腫瘤效果。方法:（1）用化學(xué)方法合成全新的、高純度的TLR7激動劑SZU-106,并用質(zhì)譜和核磁共振波普分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。（2）用ELISA方法檢測SZU-106在體外對免疫細(xì)胞的免疫激活效果... 

【文章來源】：深圳大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

SZU-106的合成

圖 2：SZU-106對 TLR7的激活作用。A.用 0.1μM, 0.5μM, 1μM, 5μM, 10μM, 20μM, 40μM 度的 SZU-106 和相同濃度的 R848 分別刺激 HEK-Blue hTLR7 細(xì)胞，得到的報(bào)告基因SEAP 的值。B、C.用 0.1μM, 0.5μM, 1μM, 5μM, 10μM, 20μM 的 SZU-106 刺激小鼠脾淋巴胞，檢測免疫因子水平。數(shù)據(jù)為一次代表性實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的平均值±SD 值(n=6)。相同的結(jié)在三次實(shí)驗(yàn)中獲得。*P＜0.05；**＜0.01；***p＜0.001。3.1.3 5-氮雜胞嘧核苷(Aza)最佳濃度確定我們用不同濃度的 Aza 刺激小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系 CT26，黑色素瘤細(xì)胞系B16-F10 和乳腺癌細(xì)胞系 4T1，用 CCK8 試劑盒檢測細(xì)胞活力后，繪制出 IC曲線。結(jié)果顯示 B16-F10 對 Aza 最敏感，其 IC50值為 3.563μM (圖 3 A)。為了得到最佳的免疫激活效果，我們選取了 IC50之前的濃度進(jìn)行篩選。用 0μM，0.5μM，1μM，3.5μM 濃度的 Aza 刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞，收集上清進(jìn)行 ELIS檢測。結(jié)果如圖 3.B、C、D所示，在 Aza濃度為 0.5μM 時(shí)，產(chǎn)生的 IFN- γ的量

29圖 3：確定 Aza最佳作用濃度。A.用 CCK8 的方法檢測 0μM，1μM，10μM，100μM的 Aza對 B16-F10 的作用，得到 IC50曲線。B、C、D.用 ELISA 方法檢測 0μM，0.5μM，1μM，3.5μM 的 Aza 對小鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激作用。數(shù)據(jù)為一次代表性實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的平均值±SD值(n=6)。在三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中得到了相同的結(jié)果。*P＜0.05；**＜0.01；***p＜0.001。3.1.4 Aza 能促進(jìn) B16-F10 細(xì)胞內(nèi) TLR3 蛋白表達(dá)量的影響用 Aza 刺激 B16-F10 細(xì)胞三天后，提取細(xì)胞的全蛋白進(jìn)行 WB 分析。結(jié)果顯示 Aza 刺激 B16-F10 細(xì)胞后，能使細(xì)胞內(nèi) TLR3 的蛋白表達(dá)量升高，且與空白對照組相比具有顯著性差異，p＜0.001。Aza對 TLR3表達(dá)的促進(jìn)效果與陽性對照 Pika相同（圖 4）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]PIKA Provides an Adjuvant Effect to Induce Strong Mucosal and Systemic Humoral Immunity Against SARS-CoV[J]. Wei-wei Gai 1,2,Yan Zhang 1,Di-han Zhou 1,Yao-qing Chen 2,Jing-yi Yang and Hui-min Yan 1,2 **(1.Mucosal Immunity Research Group,The State Key Laboratory of Virology,Wuhan Institute of Virology,Chinese Academy of Sciences,Wuhan 430072,China;2.The State Key Laboratory of Virology and Modern Virology Research Center,College of Life Sciences,Wuhan University,Wuhan 430072,China).  Virologica Sinica. 2011(02)



本文編號：2895034