研究背景腫瘤是嚴重危害人類健康的重大疾病,發(fā)病率呈逐年上升,一直是生物學和醫(yī)學界研究的重心和難題。近年來,腫瘤分子靶向藥物已為臨床腫瘤治療提供了新的有效途徑。同時,尋找新的腫瘤治療靶點也成為腫瘤研究領域的重點和熱點。Cofilin蛋白是肌動蛋白解聚因子家族成員之一,具有調(diào)控細胞骨架動態(tài)變化、有絲分裂、細胞外基質(zhì)粘附以及細胞偽足形成等多方面的功能,參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、在腫瘤細胞的侵襲和轉移、增殖和凋亡過程中發(fā)揮了重要的作用。Cofilin蛋白在腫瘤組織中的表達和激活狀態(tài)與腫瘤惡性程度密切相關,有望成為一個預測腫瘤轉移和預后的臨床靶標,開發(fā)以Cofilin為治療靶點的新型藥物,將有望為臨床腫瘤治療提供新的途徑。近年來,對Cofilin蛋白的結構功能和生物學效應研究都取得了很大的進步,但對其調(diào)控腫瘤細胞凋亡的具體分子機制尚不明確。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),十字花科蔬菜中活性成分異硫氰酸丙酯(Allyl isothiocyanate,AITC)和4-甲硫基丁基異硫氰酸酯(4-methylthiobutyl isothiocyanate,Erucin)可分別誘導多種白血病細胞和乳腺癌細胞發(fā)生線粒體途徑細胞凋亡,并且觀察到明顯的Cofilin蛋白線粒體轉位,呈現(xiàn)良好的時效量效關系。并在Erucin誘導的乳腺癌細胞凋亡過程中發(fā)現(xiàn)明顯的線粒體分裂增加,提示Cofilin線粒體轉位介導的細胞凋亡可能與線粒體分裂相關。同時,線粒體分裂和細胞自噬密切相關,已有報道,線粒體分裂可誘導線粒體自噬的發(fā)生,而肌動蛋白(Actin)在自噬的形成過程中發(fā)揮了極其重要的作用,基于Cofilin具有調(diào)控Actin解聚和聚合的基本功能以及其可能在線粒體分裂中的調(diào)控作用,提示Cofilin可能參與了線粒體自噬的調(diào)控。因此,本課題主要采用了多種影響Cofilin線粒體轉位的藥物,深入研究了Cofilin調(diào)控腫瘤細胞凋亡、線粒體損傷、線粒體分裂和線粒體自噬的分子機制,并明確了干預Cofilin線粒體轉位的藥物的抗腫瘤效應。1.1 AITC體內(nèi)外水平誘導人白血病細胞線粒體損傷和細胞凋亡伴隨著Cofilin的去磷酸化激活采用AITC處理白血病細胞和白血病患者外周血單個核細胞,流式細胞術和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)AITC可梯度濃度和時間誘導白血病細胞發(fā)生凋亡和線粒體膜電位下調(diào),凋亡相關蛋白Caspase-9、Caspase-3和PARP降解激活,伴隨著線粒體損傷標志分子細胞色素C的釋放,同時引起Cofilin蛋白去磷酸化激活。并在U937裸鼠異種移植瘤模型體內(nèi)水平驗證了AITC的抗白血病作用良好,同時伴隨著Cofilin的去磷酸化激活。1.2 AITC誘導Actin解聚以及G-actin和Cofilin線粒體共轉位Western blot和激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)AITC可梯度時間誘導絲狀肌動蛋白(F-actin)解聚成球狀肌動蛋白(G-actin),并同時伴隨著Cofilin和Actin線粒體轉位,激光共聚焦研究發(fā)現(xiàn)Cofilin僅與G-actin在線粒體發(fā)生共定位,而與F-actin幾乎無共定位。提示AITC可能通過誘導Cofilin和G-actin轉位到線粒體,并在線粒體發(fā)生相互作用,最終導致線粒體損傷和細胞凋亡。1.3 Cofilin調(diào)控的線粒體途徑細胞凋亡依賴于ROCK1/PTEN/PI3K/PPs通路的激活采用PP1/PP2A磷酸酶抑制劑Calyculin、PI3K抑制劑LY294002、ROCK1抑制劑Y-27632研究發(fā)現(xiàn)ROCK1/PTEN/PI3K/PPs通路是調(diào)控Cofilin介導的線粒體途徑細胞凋亡的關鍵上游通路。2.Cofilin調(diào)控線粒體分裂的分子機制研究2.1 Erucin誘導乳腺癌細胞線粒體損傷和凋亡伴隨著線粒體分裂Erucin可誘導乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞線粒體膜電位下調(diào),細胞凋亡增加,并同時伴隨著細胞色素C的釋放,激光共聚焦和電鏡均觀察到線粒體分裂增加。2.2 Erucin誘導的乳腺癌細胞線粒體分裂和凋亡依賴于Cofilin和Drp1的線粒體轉位Erucin可誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞Cofilin和Drp1的線粒體轉位增加。蛋白酶K消化掉線粒體外膜研究表明Cofilin和Drp1轉位后定位于線粒體外膜,免疫沉淀和激光共聚焦研究發(fā)現(xiàn)Cofilin和Drp1在線粒體外膜呈現(xiàn)直接結合的共定位。分別基因敲降Cofilin和Drp1均能顯著降低線粒體外膜Cofilin和Drp1的直接結合和共定位,同時可阻斷Erucin誘導的線粒體分裂和細胞凋亡。2.3 ROCK1調(diào)控了Cofilin和Drp1去磷酸化激活和線粒體轉位分別構建Cofilin絲氨酸3(Ser 3)位點和Drp1絲氨酸637(Ser 637)位點的磷酸化和去磷酸化突變質(zhì)粒研究發(fā)現(xiàn)Cofilin和Drp1線粒體轉位主要依賴于Cofilin Ser3位點和Drp1 Ser637位點去磷酸化激活。基因敲降ROCK1或采用其抑制劑Y-27632均能研究內(nèi)容和結果1.Cofilin調(diào)控線粒體損傷和細胞凋亡的分子機制研究阻斷Erucin誘導的Cofilin和Drp1的去磷酸化激活,線粒體分裂和細胞凋亡。2.4裸鼠體內(nèi)實驗驗證了Cofilin和Drp1介導的線粒體分裂在Erucin抗乳腺癌移植瘤中的重要作用3 Cofilin調(diào)控線粒體自噬的分子機制研究3.1 PINK1/Park2介導的線粒體自噬伴隨著Cofilin的線粒體轉位和線粒體分裂采用多種線粒體分裂誘導劑(STS、ETO、CCCP)處理乳腺癌MDA-MB-231細胞,激光共聚焦和電鏡觀察到Cofilin的線粒體轉位、線粒體分裂和線粒體自噬增加,Western blot檢測到Cofilin蛋白的線粒體轉位以及PINK1/Park2線粒體自噬通路的激活。3.2線粒體自噬的發(fā)生依賴于Cofilin的線粒體轉位基因敲降Cofilin可顯著阻斷STS、ETO、CCCP誘導的線粒體分裂和PINK1/Park2通路的激活,減少線粒體自噬的發(fā)生,而過表達Cofilin則可顯著增加線粒體分裂和線粒體自噬的發(fā)生。3.3 Cofilin通過影響線粒體膜電位調(diào)控線粒體自噬敲降Cofilin可顯著阻斷STS、ETO、CCCP誘導的線粒體膜電位下調(diào),阻斷藥物誘導的PINK1切割蛋白酶(MPPβ/PARL/AFG3L2)表達下調(diào);而Cofilin過表達則與敲降結果相反,提示Cofilin可能通過調(diào)控線粒體膜電位從而調(diào)控PINK1蛋白的活化及線粒體自噬的發(fā)生。3.4 Cofilin通過調(diào)控線粒體分裂位點的Actin轉換調(diào)控線粒體分裂和線粒體自噬多種線粒體分裂誘導藥物均能誘導Cofilin和G-Actin發(fā)生線粒體轉位,并在線粒體外膜上發(fā)生共定位;Actin聚合抑制劑(Latrunculin B)、解聚抑制劑(Jasplakinolide)均能阻斷藥物誘導的線粒體分裂和線粒體自噬;激光共聚焦發(fā)現(xiàn)Cofilin在線粒體分裂位點介導的F-actin/G-actin轉換在調(diào)控線粒體分裂和線粒體自噬過程中發(fā)揮了重要的作用。結論本課題主要采用了多種影響Cofilin線粒體轉位的藥物,深入研究了Cofilin調(diào)控線粒體途徑細胞凋亡和線粒體自噬分子機制,取得的主要結論如下:1.異硫氰酸丙酯(AITC)可誘導白血病細胞凋亡,主要通過誘導ROCK1/PTEN/PI3K/PPs通路的激活,引起Cofilin去磷酸化激活,激活的Cofilin會與G-actin轉位到線粒體,在線粒體發(fā)生相互作用,調(diào)控線粒體損傷,導致細胞色素C釋放和細胞凋亡。2.4-甲硫基丁基異硫氰酸酯(Erucin)可誘導Cofilin和線粒體分裂關鍵分子Drp1第三軍醫(yī)大學博士學位論文發(fā)生線粒體轉位,兩者在線粒體外膜發(fā)生直接的相互作用,調(diào)控線粒體分裂,從而導致乳腺癌細胞線粒體損傷,細胞色素C釋放和細胞凋亡。3.采用多種線粒體分裂誘導劑(STS、ETO、CCCP)研究Cofilin調(diào)控的線粒體自噬機制發(fā)現(xiàn),Cofilin是通過調(diào)控線粒體外膜分裂位點的Actin轉換而參與調(diào)控了線粒體分裂,進而引起線粒體膜電位下調(diào),導致PINK1/Park2途徑激活和線粒體自噬的發(fā)生。
【學位單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R730.2
【文章目錄】：
縮略語表
英文摘要
中文摘要
第一章 前言
第二章 Cofilin調(diào)控線粒體損傷和細胞凋亡的分子機制研究
    2.1 材料與方法
    2.2 結果
    2.3 討論
    2.4 小結
第三章 Cofilin調(diào)控線粒體分裂的分子機制研究
    3.1 材料與方法
    3.2 結果
    3.3 討論
    3.4 小結
第四章 Cofilin調(diào)控線粒體自噬的分子機制研究
    4.1 材料與方法
    4.2 結果
    4.3 討論
    4.4 小結
全文總結
參考文獻
文獻綜述 Cofilin蛋白功能與腫瘤關系
    參考文獻
攻讀學位期間的研究成果
致謝

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本文編號：2894791