[目的]肺癌,作為全世界,尤其是亞洲地區(qū)最為常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率、死亡率均居高不下。宣威肺癌(Lung cancer in Xuanwei,LCXW)是位于云南省東北部地區(qū)人群易發(fā)的一種肺癌,該地區(qū)的肺癌發(fā)病率和死亡率均高于全國平均水平,并呈不斷上升趨勢。由于缺乏敏感的檢測標志物及有效的治療方式,大多數(shù)宣威肺癌患者在出現(xiàn)癥狀前往醫(yī)院就診時,已處于癌癥晚期階段,因此喪失了最佳的治療機會,給患者生理、心理均造成嚴重的打擊。因此,尋找針對宣威肺癌的有效標志物,對早期診斷宣威肺癌具有重大意義。CircRNA以其具有穩(wěn)定性,時間、組織表達特異性等特點,更適于反映疾病的發(fā)展階段。本課題組應用circRNAs芯片對宣威肺癌組織中差異表達的circRNAs進行篩選,再進一步采用實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)對芯片中差異表達的circRNA進一步驗證,以期初步篩選出可作為診斷宣威肺癌的潛在標志物。[方法]1.將26對宣威肺癌樣本分別提取RNA后,按照分期(Ⅰ期:10/26;Ⅱ期:9/26;Ⅲ期:7/26)及組織來源(癌和癌旁)分為6組,每組內(nèi)各樣本混合后利用Arraystar Human circRNA Array V2分析circRNAs表達情況。采用箱圖、火山圖等方法,建立宣威地區(qū)肺癌相關circRNAs差異表達譜,Fold Change≥2認為差異是有統(tǒng)計學意義的,并通過生物信息學分析方法預測circRNAs的下游靶miRNA。2.對差異表達的circRNAs進行分析篩選,具體包括:①Fold Change越大越好;②每個樣本的 Raw Intensity≥200;③CircRNAs 長度在 200-2000bp;④P-value越小越好;⑤現(xiàn)有研究已證實預測靶miRNAs或宿主基因與癌癥有關的circRNAs。3.設計引物,采用RT-qPCR的方法,在50對宣威肺癌中進行候選circRNAs的表達驗證。4.對患者的臨床病例資料進行統(tǒng)計分析,運用統(tǒng)計學方法研究宣威肺癌患者候選circRNA的表達是否具有顯著差異,采用Kaplan-Meier生存分析法評估circRNA的表達與宣威肺癌預后的關系,并分析差異表達的circRNAs與患者性別、年齡、吸煙史、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及腫瘤大小的相關性。[結(jié)果]1.通過circRNAs芯片技術發(fā)現(xiàn):宣威肺癌中存在大量差異表達的circRNAs,其中Ⅰ期差異表達的circRNAs,上調(diào)的有717個,下調(diào)的有1055個;Ⅱ期差異表達的circRNAs,上調(diào)的有612個,下調(diào)的有806個;Ⅲ期差異表達的circRNAs,上調(diào)的有183個,下調(diào)的有455個;在3個時期中均出現(xiàn)差異表達的circRNAs共有537個,其中143個上調(diào),394個下調(diào),每個circRNA預測出5個可能結(jié)合的 miRNA。2.通過對差異表達的circRNAs篩選,再結(jié)合文獻查閱其預測的下游靶miRNA功能,篩選出8個有價值的circRNAs進行后續(xù)研究。3.根據(jù)circRNAs的結(jié)構(gòu)設計引物,并進行引物條件摸索,僅4個篩選出的circRNAs 的引物設計成功(hsa_circRNA_104600、hsa_circRNA_069397、hsa_circRNA_105013、hsa_circRNA_406010),采用 RT-qPCR 的方法,對這 4 個circRNA進行組織水平的表達驗證。發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_104600(顯著上調(diào))、hsa_circRNA_105013(顯著上調(diào))、hsa_circRNA_406010(顯著下調(diào))在 50 對宣威肺癌組織中表達出現(xiàn)顯著差異,其中hsa_circRNA_104600、hsa_circRNA_406010的組織驗證結(jié)果與芯片結(jié)果一致,而hsa_circRNA_105013的組織驗證結(jié)果與芯片結(jié)果不一致。4.采用統(tǒng)計學的方法對患者的臨床病例資料進行分析,發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_104600、hsa_circRNA_105013的上調(diào)均與腫瘤大小有相關性。hsa_circRNA_406010下調(diào)的宣威肺癌患者預后較差。[結(jié)論]1.通過circRNAs芯片發(fā)現(xiàn)在宣威肺癌癌組織和癌旁組織中存在大量差異表達的 circRNAs。2.通過 RT-qPCR 顯示 hsa_circrna_104600、hsa_circrna_105013 和hsa_circrna_406010 在宣威肺癌中異常表達,hsa_circrna_104600 和hsa_circrna_105013的表達差異水平與腫瘤大小具有相關性,而hsa_circrna_406010的表達差異水平與宣威肺癌患者預后相關。提示hsa_circrna_104600、hsa_circrna_105013 和 hsa_circrna_406010 可能成為診斷宣威肺癌的潛在的生物標志物。3.本研究為宣威肺癌發(fā)病機制研究、診治及預后評估提供了新的研究數(shù)據(jù)。
【學位單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2
【部分圖文】：

?４０?４４８０３．２?Ｐａｓｓ??２．２總ＲＮＡ跑膠圖見圖１－１，可見有２８ｓ、１８ｓ及５ｓ條帶，表明所提取的ＲＮＡ較??為完整，可以認為樣本ＲＮＡ沒有降解，樣本合格，可用于后續(xù)實驗。??１８ｓ?Ｉ?１?％?－；：?Ｍ??５ｓ?Ｉ?

圖１－２箱圖??

３芯片結(jié)果分析??３．１?６組樣本芯片掃描后的分析??箱圖（圖１－２）表明６組樣本檢測結(jié)果有良好的均一性：火山圖（圖１－３，由??差異倍數(shù)和Ｐ值所得，垂直線相當于宣威地區(qū)肺癌癌組織相較于癌旁組織的２??倍上調(diào)或下調(diào)，水平線代表尸值，圖中的紅點代表顯著差異表達的ｃｉｒｃＲＮＡｓ，??顯示Ａ與Ｐ存在顯著差異表達的ｃｉｒｃＲＮＡｓ。??１８?｜?，?，?，?，???１６?！?？?ｉ??①??２?１４?－?－??１２?－
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本文編號：2894002