發(fā)布時間：2020-11-21 14:50

　　 目的:肝癌是全球發(fā)病率位居第六的癌癥,但目前已成為癌癥致死的第二大因素。今一線靶向藥Sorafenib,已出現(xiàn)耐藥及肝癌轉移復發(fā),然而新被批準的二線治療藥物瑞戈非尼(Regorafenib)是否會發(fā)生耐藥及耐藥后的相關機制均不清楚。我們此前的研究表明,脯氨酰順反異構酶Pin1在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。因此,本文重點考察在肝癌細胞瑞戈非尼耐藥前后,Pin1對侵襲轉移的影響,并從EMT的角度探討其相關機制,以發(fā)現(xiàn)潛在緩解肝癌瑞戈非尼耐藥的策略。方法:(1)Western Blot及免疫熒光實驗檢測肝癌臨床標本中Pin1及EMT相關蛋白表達的關系。(2)五質(zhì)粒系統(tǒng)包裝Pin1敲減或過表達的慢病毒,感染MHCC-97H、Huh7、THLE3細胞,篩選建立穩(wěn)定敲減或過表達Pin1的肝癌細胞株。(3)以SMMC-7721肝癌細胞為研究對象,采用Regorafenib藥物低濃度(0.5μM)開始,梯度間歇誘導的方法,篩選出瑞戈非尼耐藥株SMMC-7721-R-R;計算出相應的耐藥指數(shù)(resistance index,RI=耐藥細胞的IC50/親代細胞的IC50)。(4)相差顯微鏡觀察并拍照收集肝癌細胞耐藥前后及Pin1敲減前后細胞形態(tài)的改變。(5)觀察Pin1敲減或過表達對MHCC-97H、Huh7、THLE3、SMMC-7721-R-R細胞株生物學行為的影響:生長曲線及平板克隆實驗檢測Pin1敲減或過表達對細胞增殖能力的影響;Transwell小室實驗及劃痕實驗檢測Pin1敲減或過表達對細胞遷移侵襲能力的影響;(6)Western Blot及免疫熒光實驗檢測Pin1敲減對EMT相關蛋白、干性相關蛋白及Gli1通路蛋白表達影響。(7)構建裸鼠尾靜脈注射肺轉移模型,HE染色及免疫熒光檢測Pin1敲減對肝癌細胞體內(nèi)轉移的影響。(8)干細胞培養(yǎng)條件,檢測SMMC-7721細胞瑞戈非尼耐藥前后,Pin1敲減及Pin1抑制劑ATRA對肝癌細胞成球能力的影響。結果:(1)肝癌臨床標本中,Pin1表達與EMT相關蛋白表達水平具有一定關系。(2)成功構建了穩(wěn)定敲減Pin1的肝癌細胞株,Huh7細胞中Pin1下調(diào)88%,MHCC-97H細胞中Pin1下調(diào)76%。(3)成功構建SMMC-7721瑞戈非尼耐藥細胞株SMMC-7721-R-R,RI=1.53,為低度耐藥。(4)Pin1敲減后細胞發(fā)生了明顯的MET表型變化,表現(xiàn)為細胞極性的回復,細胞由不規(guī)則的形態(tài)變?yōu)榕帕姓R,形態(tài)規(guī)則的鋪路石狀細胞。(5)Pin1敲減或ATRA作用后,細胞增殖及克隆形成能力顯著受到抑制(P0.001);Transwell小室及劃痕實驗表明,Pin1敲減使細胞遷移侵襲能力明顯減弱(P0.001)。(6)Western Blot及免疫熒光結果顯示Pin1敲減后,Pin1表達顯著下調(diào),上皮標記物E-cadherin表達顯著上調(diào),間質(zhì)標志物Vimentin表達顯著下調(diào),轉錄因子Snail顯著下調(diào),Gli1顯著下調(diào)。瑞戈非尼耐藥株中干性相關基因Bmi1顯著下調(diào)。(7)Pin1敲減有效減弱了細胞在裸鼠體內(nèi)的轉移能力(P0.001)。(8)肝癌細胞株瑞戈非尼耐藥后,細胞成球能力明顯增強,干性增加;Pin1敲減及Pin1抑制劑ATRA作用后,肝癌細胞瑞戈非尼耐藥株干性相關蛋白的表達減少,成球能力明顯受到抑制。結論:(1)肝癌細胞瑞戈非尼耐藥后細胞遷移侵襲及體內(nèi)轉移能力顯著增加,Pin1敲減及Pin1抑制劑ATRA可有效抑制肝癌細胞的增殖及瑞戈非尼耐藥前后肝癌細胞的遷移侵襲及體內(nèi)轉移能力。(2)Pin1可能通過Gli1控制EMT相關蛋白的表達進而調(diào)控肝癌細胞瑞戈非尼耐藥前后的遷移侵襲及體內(nèi)轉移能力。(3)Pin1敲減及Pin1抑制劑ATRA能明顯抑制肝癌細胞瑞戈非尼耐藥后的干細胞成球能力。Pin1在肝癌細胞瑞戈非尼耐藥前后的調(diào)節(jié)作用為臨床指導瑞戈非尼用藥及抑制肝癌瑞戈非尼耐藥后的轉移復發(fā)提供了有效的臨床指導,對于肝癌的治療具有指導意義。
【學位單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

1.肝癌臨床樣本中，Pin1 蛋白表達與 EMT 相關蛋白表達相關腫瘤的轉移與腫瘤細胞的遷移侵襲能力具有密切的相關性，研究表明當腫瘤細胞經(jīng)歷上皮間質(zhì)轉化（EMT）過程后，會增加細胞的遷移侵襲能力，進而促進腫瘤細胞在體內(nèi)的轉移能力。Pin1 在大多數(shù)肝癌細胞中處于高表達狀態(tài)。為了檢測肝癌臨床樣本中 Pin1 與EMT 相關蛋白表達水平的關系，我們對肝癌臨床樣本進行蛋白提取以及 OCT 包埋后制作冰凍切片，采用 Western Blot 及免疫熒光實驗來評估肝癌臨床樣本中 Pin1表達與 EMT 相關蛋白表達的關系。發(fā)現(xiàn) Pin1 在肝癌臨床樣本中表達有高低之分，Pin1 高表達的樣本，轉錄因子 Snail 表達增加，E-cadherin 表達明顯下調(diào)，相反，Pin1 低表達的樣本中，Snail 表達減少，E-cadherin 表達明顯上調(diào)。說明肝癌臨床樣本中，Snail 蛋白的表達隨著 Pin1 表達的增加而增加，E-cadherin 的表達隨著 Pin1表達的增加而減少。（圖 1.1）

2. Pin1 敲減對肝癌細胞增殖及遷移侵襲能力的影響研究表明，在肝癌中 Pin1 表達與不良預后有關，Pin1 高表達促進腫瘤的浸潤轉移。研究發(fā)現(xiàn)在正常的人類乳腺癌上皮細胞 HMLE 中過表達 Pin1 可誘導細胞上皮間質(zhì)轉化（EMT），EMT 與腫瘤侵襲轉移有關。肝癌臨床標本中，Pin1 表達具有 EMT 特性，所以我們假設：肝癌細胞中，Pin1 可使肝癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉化進而調(diào)控肝癌細胞的遷移侵襲。2.1 Pin1 敲減后細胞表型及蛋白表達變化相差顯微鏡觀察 Huh7、MHCC-97H 細胞感染 Pin1 敲減的慢病毒后，細胞觸角及突出逐漸縮回，變?yōu)橹苓吂饣�，排列整齊的細胞，細胞形態(tài)向著上皮形態(tài)發(fā)展。（圖 2.1）Pin1 敲減后，Western Blot 檢測 Pin1 敲減效果，Huh7 細胞中 Pin1下調(diào) 88%，MHCC-97H 細胞中 Pin1 下調(diào) 76%。（圖 2.1）

圖 2.3 Pin1 敲減抑制肝癌細胞遷移侵襲能力（A、B）Huh7 及 MHCC-97H 細胞，0 h 及 72 h 劃痕實驗采集同一點，遷移面積。（P<0.001，Bar=100μm）（C、D）Huh7 及 MHCC-97H 細胞,Transwell 小室實驗檢測 72 h，肝癌細侵襲能力。（P<0.001， Bar=100μm）3. Pin1 過表達對肝細胞增殖及遷移侵襲能力的影響通過上述研究，我們發(fā)現(xiàn)，Pin1 能促進肝癌細胞的增殖及遷移侵襲了再次驗證 Pin1 對細胞增殖及遷移侵襲能力的影響，我們在正常肝細胞Pin1 過表達及空載對照細胞，檢測 Pin1 過表達對肝細胞增殖及遷移能力3.1 Pin1 過表達促進了肝細胞的增殖能力我們在正常肝細胞中構建了 Pin1 過表達及空載對照細胞，相差顯微
【參考文獻】

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本文編號：2893165