目的:肝癌是全球發(fā)病率位居第六的癌癥,但目前已成為癌癥致死的第二大因素。今一線靶向藥Sorafenib,已出現(xiàn)耐藥及肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā),然而新被批準(zhǔn)的二線治療藥物瑞戈非尼(Regorafenib)是否會發(fā)生耐藥及耐藥后的相關(guān)機(jī)制均不清楚。我們此前的研究表明,脯氨酰順反異構(gòu)酶Pin1在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。因此,本文重點考察在肝癌細(xì)胞瑞戈非尼耐藥前后,Pin1對侵襲轉(zhuǎn)移的影響,并從EMT的角度探討其相關(guān)機(jī)制,以發(fā)現(xiàn)潛在緩解肝癌瑞戈非尼耐藥的策略。方法:(1)Western Blot及免疫熒光實驗檢測肝癌臨床標(biāo)本中Pin1及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的關(guān)系。(2)五質(zhì)粒系統(tǒng)包裝Pin1敲減或過表達(dá)的慢病毒,感染MHCC-97H、Huh7、THLE3細(xì)胞,篩選建立穩(wěn)定敲減或過表達(dá)Pin1的肝癌細(xì)胞株。(3)以SMMC-7721肝癌細(xì)胞為研究對象,采用Regorafenib藥物低濃度(0.5μM)開始,梯度間歇誘導(dǎo)的方法,篩選出瑞戈非尼耐藥株SMMC-7721-R-R;計算出相應(yīng)的耐藥指數(shù)(resistance index,RI=耐藥細(xì)胞的IC50/親代細(xì)胞的IC50)。(4)相差顯微鏡觀察并拍照收集肝癌細(xì)胞耐藥前后及Pin1敲減前后細(xì)胞形態(tài)的改變。(5)觀察Pin1敲減或過表達(dá)對MHCC-97H、Huh7、THLE3、SMMC-7721-R-R細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響:生長曲線及平板克隆實驗檢測Pin1敲減或過表達(dá)對細(xì)胞增殖能力的影響;Transwell小室實驗及劃痕實驗檢測Pin1敲減或過表達(dá)對細(xì)胞遷移侵襲能力的影響;(6)Western Blot及免疫熒光實驗檢測Pin1敲減對EMT相關(guān)蛋白、干性相關(guān)蛋白及Gli1通路蛋白表達(dá)影響。(7)構(gòu)建裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型,HE染色及免疫熒光檢測Pin1敲減對肝癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響。(8)干細(xì)胞培養(yǎng)條件,檢測SMMC-7721細(xì)胞瑞戈非尼耐藥前后,Pin1敲減及Pin1抑制劑ATRA對肝癌細(xì)胞成球能力的影響。結(jié)果:(1)肝癌臨床標(biāo)本中,Pin1表達(dá)與EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平具有一定關(guān)系。(2)成功構(gòu)建了穩(wěn)定敲減Pin1的肝癌細(xì)胞株,Huh7細(xì)胞中Pin1下調(diào)88%,MHCC-97H細(xì)胞中Pin1下調(diào)76%。(3)成功構(gòu)建SMMC-7721瑞戈非尼耐藥細(xì)胞株SMMC-7721-R-R,RI=1.53,為低度耐藥。(4)Pin1敲減后細(xì)胞發(fā)生了明顯的MET表型變化,表現(xiàn)為細(xì)胞極性的回復(fù),細(xì)胞由不規(guī)則的形態(tài)變?yōu)榕帕姓R,形態(tài)規(guī)則的鋪路石狀細(xì)胞。(5)Pin1敲減或ATRA作用后,細(xì)胞增殖及克隆形成能力顯著受到抑制(P0.001);Transwell小室及劃痕實驗表明,Pin1敲減使細(xì)胞遷移侵襲能力明顯減弱(P0.001)。(6)Western Blot及免疫熒光結(jié)果顯示Pin1敲減后,Pin1表達(dá)顯著下調(diào),上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)顯著上調(diào),間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達(dá)顯著下調(diào),轉(zhuǎn)錄因子Snail顯著下調(diào),Gli1顯著下調(diào)。瑞戈非尼耐藥株中干性相關(guān)基因Bmi1顯著下調(diào)。(7)Pin1敲減有效減弱了細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力(P0.001)。(8)肝癌細(xì)胞株瑞戈非尼耐藥后,細(xì)胞成球能力明顯增強(qiáng),干性增加;Pin1敲減及Pin1抑制劑ATRA作用后,肝癌細(xì)胞瑞戈非尼耐藥株干性相關(guān)蛋白的表達(dá)減少,成球能力明顯受到抑制。結(jié)論:(1)肝癌細(xì)胞瑞戈非尼耐藥后細(xì)胞遷移侵襲及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力顯著增加,Pin1敲減及Pin1抑制劑ATRA可有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖及瑞戈非尼耐藥前后肝癌細(xì)胞的遷移侵襲及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。(2)Pin1可能通過Gli1控制EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控肝癌細(xì)胞瑞戈非尼耐藥前后的遷移侵襲及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。(3)Pin1敲減及Pin1抑制劑ATRA能明顯抑制肝癌細(xì)胞瑞戈非尼耐藥后的干細(xì)胞成球能力。Pin1在肝癌細(xì)胞瑞戈非尼耐藥前后的調(diào)節(jié)作用為臨床指導(dǎo)瑞戈非尼用藥及抑制肝癌瑞戈非尼耐藥后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)提供了有效的臨床指導(dǎo),對于肝癌的治療具有指導(dǎo)意義。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

1.肝癌臨床樣本中，Pin1 蛋白表達(dá)與 EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)相關(guān)腫瘤的轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力具有密切的相關(guān)性，研究表明當(dāng)腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程后，會增加細(xì)胞的遷移侵襲能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力。Pin1 在大多數(shù)肝癌細(xì)胞中處于高表達(dá)狀態(tài)。為了檢測肝癌臨床樣本中 Pin1 與EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平的關(guān)系，我們對肝癌臨床樣本進(jìn)行蛋白提取以及 OCT 包埋后制作冰凍切片，采用 Western Blot 及免疫熒光實驗來評估肝癌臨床樣本中 Pin1表達(dá)與 EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的關(guān)系。發(fā)現(xiàn) Pin1 在肝癌臨床樣本中表達(dá)有高低之分，Pin1 高表達(dá)的樣本，轉(zhuǎn)錄因子 Snail 表達(dá)增加，E-cadherin 表達(dá)明顯下調(diào)，相反，Pin1 低表達(dá)的樣本中，Snail 表達(dá)減少，E-cadherin 表達(dá)明顯上調(diào)。說明肝癌臨床樣本中，Snail 蛋白的表達(dá)隨著 Pin1 表達(dá)的增加而增加，E-cadherin 的表達(dá)隨著 Pin1表達(dá)的增加而減少。（圖 1.1）

2. Pin1 敲減對肝癌細(xì)胞增殖及遷移侵襲能力的影響研究表明，在肝癌中 Pin1 表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)，Pin1 高表達(dá)促進(jìn)腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)在正常的人類乳腺癌上皮細(xì)胞 HMLE 中過表達(dá) Pin1 可誘導(dǎo)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），EMT 與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。肝癌臨床標(biāo)本中，Pin1 表達(dá)具有 EMT 特性，所以我們假設(shè)：肝癌細(xì)胞中，Pin1 可使肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)而調(diào)控肝癌細(xì)胞的遷移侵襲。2.1 Pin1 敲減后細(xì)胞表型及蛋白表達(dá)變化相差顯微鏡觀察 Huh7、MHCC-97H 細(xì)胞感染 Pin1 敲減的慢病毒后，細(xì)胞觸角及突出逐漸縮回，變?yōu)橹苓吂饣�，排列整齊的細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)向著上皮形態(tài)發(fā)展。（圖 2.1）Pin1 敲減后，Western Blot 檢測 Pin1 敲減效果，Huh7 細(xì)胞中 Pin1下調(diào) 88%，MHCC-97H 細(xì)胞中 Pin1 下調(diào) 76%。（圖 2.1）

圖 2.3 Pin1 敲減抑制肝癌細(xì)胞遷移侵襲能力（A、B）Huh7 及 MHCC-97H 細(xì)胞，0 h 及 72 h 劃痕實驗采集同一點，遷移面積。（P<0.001，Bar=100μm）（C、D）Huh7 及 MHCC-97H 細(xì)胞,Transwell 小室實驗檢測 72 h，肝癌細(xì)侵襲能力。（P<0.001， Bar=100μm）3. Pin1 過表達(dá)對肝細(xì)胞增殖及遷移侵襲能力的影響通過上述研究，我們發(fā)現(xiàn)，Pin1 能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖及遷移侵襲了再次驗證 Pin1 對細(xì)胞增殖及遷移侵襲能力的影響，我們在正常肝細(xì)胞Pin1 過表達(dá)及空載對照細(xì)胞，檢測 Pin1 過表達(dá)對肝細(xì)胞增殖及遷移能力3.1 Pin1 過表達(dá)促進(jìn)了肝細(xì)胞的增殖能力我們在正常肝細(xì)胞中構(gòu)建了 Pin1 過表達(dá)及空載對照細(xì)胞，相差顯微
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2893165