目的:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一類起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病,AML患者長(zhǎng)期生存率低,容易復(fù)發(fā),復(fù)發(fā)的主要原因和化療藥物不易進(jìn)入髓外浸潤(rùn)的白血病病灶有關(guān)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是白血病髓外浸潤(rùn)的常見(jiàn)部位,血腦屏障是白血病細(xì)胞進(jìn)行中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)過(guò)程中必須穿過(guò)的結(jié)構(gòu),而腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接是血腦屏障的主要組成成分。白血病細(xì)胞浸潤(rùn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)制目前尚不清楚。外泌體是細(xì)胞主動(dòng)分泌的內(nèi)含RNA、microRNA(miRNA或miR)等多種成分的囊泡結(jié)構(gòu),腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體能與靶細(xì)胞融合,外泌體中的miRNA可調(diào)控靶細(xì)胞的基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)外泌體miRNA可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移,腦部炎癥時(shí)高表達(dá)的miR-155能破壞腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接,增加血腦屏障的通透性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),miR-155在AML患者血漿外泌體中高表達(dá),那么白血病細(xì)胞是否通過(guò)分泌外泌體與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞融合,外泌體miR-155破壞內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接,從而導(dǎo)致白血病細(xì)胞浸潤(rùn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)?目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)這方面的報(bào)道。為此,本研究探討AML細(xì)胞株HL-60來(lái)源的外泌體miR-155對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的影響,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步的研究,這對(duì)進(jìn)一步闡明白血病細(xì)胞浸潤(rùn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分子機(jī)制,尋找新的抗浸潤(rùn)治療的的分子靶標(biāo),研發(fā)新的有效治療AML的方法,提高患者生存率具有十分重要和深遠(yuǎn)的意義。此外,還可為其它類型白血病細(xì)胞浸潤(rùn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分子機(jī)制和治療的研究提供新的思路。方怯:1、外泌體的抽提和鑒定:利用Total Exosome Isolation Reagent外泌體提取試劑盒從AML細(xì)胞株HL-60和THP-1培養(yǎng)上清中分離外泌體。并通過(guò)透射電鏡觀察外泌體形態(tài)大小;ZETASIZERNano series-Nano-ZS儀器檢測(cè)外泌體粒徑大小;流式細(xì)胞儀分析外泌體表面標(biāo)志性蛋白CD63和CD81的表達(dá),對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定。2、AML細(xì)胞株及其來(lái)源的外泌體miR-155的表達(dá)分析:利用熒光定量PCR方法檢測(cè)HL-60、THP-1細(xì)胞及其外泌體中miR-155的表達(dá)水平。3、慢病毒包裝:通過(guò)酶切、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽提、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、濃縮純化等方法構(gòu)建并包裝miR-155過(guò)表達(dá)和miR-155抑制表達(dá)慢病毒,并對(duì)病毒進(jìn)行物理檢測(cè)、無(wú)菌檢測(cè)、滴度檢測(cè)等質(zhì)量檢測(cè)。4、miR-155過(guò)表達(dá)和miR-155抑制表達(dá)HL-60細(xì)胞株的構(gòu)建:miR-155過(guò)表達(dá)和miR-155抑制表達(dá)的慢病毒感染HL-60細(xì)胞株。5、miR-155過(guò)表達(dá)和miR-155抑制表達(dá)HL-60細(xì)胞株及其來(lái)源的外泌體中miR-155的表達(dá)分析:利用熒光定量PCR方法檢測(cè)慢病毒感染后HL-60細(xì)胞以及其來(lái)源的外泌體中miR-155的表達(dá)水平。6、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞攝取外泌體的分析:將從miR-155過(guò)表達(dá)、miR-155抑制表達(dá)的HL-60細(xì)胞株培養(yǎng)上清中提取的,并用CM-DIL標(biāo)記的外泌體,與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞HBMEC共培養(yǎng)后,用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞攝取外泌體。7、外泌體miR-155對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞跨膜阻抗及其緊密連接完整性影響的檢測(cè):用跨膜電阻儀和免疫熒光法分別檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞跨膜阻抗值(TEER)和內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的完整性。8、外泌體miR-155對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1基因表達(dá)影響的檢測(cè):利用熒光定量PCR方法檢測(cè)外泌體miR-155對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1基因表達(dá)水平的影響。9、外泌體miR-155對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1蛋白表達(dá)影響的檢測(cè):利用WestenBlot方法檢測(cè)AML外泌體miR-155對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白Z0-1蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果:1、外泌體的特性:從白血病細(xì)胞株HL-60、THP-1培養(yǎng)液中均分離得到了大小較為均一的圓形、類圓形的囊泡狀物質(zhì),直徑在30-150nm之間,其包膜完整,邊緣清晰,內(nèi)有低電子密度小顆粒,標(biāo)志性蛋白CD63和CD81陽(yáng)性表達(dá)率分別為 86.1%和 92.1%。2、AML細(xì)胞株及其來(lái)源的外泌體miR-155的表達(dá):通過(guò)熒光定量PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),miR-155在HL-60和THP-1兩種細(xì)胞及其來(lái)源的外泌體中均有表達(dá),miR-155在HL-60細(xì)胞的表達(dá)是其在THP-1細(xì)胞中的表達(dá)的8.12倍,在HL-60細(xì)胞來(lái)源的外泌體中的表達(dá)是THP-1細(xì)胞來(lái)源的外泌體中的表達(dá)的6.73倍;差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3、miR-155過(guò)表達(dá)和miR-155抑制表達(dá)的HL-60細(xì)胞株及其來(lái)源外泌體中miR-155的表達(dá):構(gòu)建的miR-155過(guò)表達(dá)和miR-155抑制表達(dá)慢病毒,轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染率超過(guò)80%,與對(duì)照組相比,miR-155過(guò)表達(dá)細(xì)胞株及其來(lái)源的外泌體中miR-155的表達(dá)分別增高10.03倍和13.75倍,miR-155抑制表達(dá)細(xì)胞株及其來(lái)源的外泌體中miR-155的表達(dá)分別降低5.55倍和2.53倍;差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)外泌體的攝取:過(guò)表達(dá)miR-155和抑制表達(dá)miR-155的HL-60細(xì)胞株來(lái)源的外泌體和HBMEC共培養(yǎng)后,能被腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞攝取。5、外泌體miR-155對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞跨膜阻抗及其緊密連接完整性的影響:與對(duì)照組和抑制表達(dá)miR-155的外泌體相比較,過(guò)表達(dá)miR-155的外泌體顯著降低腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的跨膜阻抗值(P0.05),并破壞腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接的完整性。6、外泌體miR-155對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接關(guān)鍵分子ZO-1基因和蛋白表達(dá)水平的影響:與對(duì)照組和抑制表達(dá)miR-155的外泌體相比較,過(guò)表達(dá)miR-155的外泌體顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接關(guān)鍵分子ZO-1基因表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平(P0.05)。結(jié)論:1.AML外泌體miR-155進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞。2.AML外泌體miR-155降低腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞電阻抗值,破壞緊密連接完整性。3.AML外泌體miR-155對(duì)緊密連接關(guān)鍵分子ZO-1具有負(fù)調(diào)控作用。
【學(xué)位單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R733.71
【部分圖文】：

要的結(jié)構(gòu)蛋白、特異性酶、ｇａｇ和ｐｏｌ基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。ｐＨｅｌｐｅｒ?２．０載體中??攜帶有單純皰瘆病毒來(lái)源的ＶＳＶ－Ｇ基因，可以為病毒包裝提供所需要的包膜蛋??白。ｐＨｅｌｐｅｒ?１．０和ｐＨｅｌｐｅｒ?２．０病毒載體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖２。??ｙ?１?－??圖１?ｍｉＲ－１５５過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)慢病毒載體結(jié)構(gòu)圖??Ａ：?ＧＶ３６９?為?ｍｉＲ－１５５?過(guò)表達(dá)慢病毒載體，原件順序?Ｕｂｉ－ＭＣＳ－ＳＶ４０－ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ??Ｂ：?ＧＶ２３４為ｍｉＲ－１５５抑制表達(dá)慢病毒載體，原件順序?yàn)椋瑁眨叮停茫樱茫停郑牛牵疲??占Ｉ?Ｈｅｌｐｅｒｌ?．０?！?＼?〇／?Ｈｅｌｐｅｒ２．０?＼??／＼Ｕ３?Ｒ?昍??＇??圖２?Ａ為Ｈｅｌｐｅｒ?１．０病毒載體，Ｂ為Ｈｅｌｐｅｒ?２．０病毒載體??載體酶切：??按照下表順序依次加入各種試劑，配制反應(yīng)體系將載體進(jìn)行酶切。反應(yīng)體系??配制完成后，用移液槍小心抽吸混勻，輕微離心，３７°Ｃ孵育過(guò)夜。將載體酶切??產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并回收其目的條帶。??１４??

３．１．２外泌體的粒徑大小??重懸后的外泌體樣品，通過(guò)ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ?Ｎａｎｏ?ｓｅｒｉｅｓ－Ｎａｎｏ－ＺＳ儀器進(jìn)行分析，??結(jié)果如圖４所示，檢測(cè)到的外泌體粒徑主峰為６６．６３ｎｍ，平均粒徑為３１．２５，其??中２０ｎｍ－２００ｎｍ范圍７２．２％，平均粒徑以及粒徑主峰均與公認(rèn)的外泌體粒徑大小??吻合。且檢測(cè)得到的粒子分布系數(shù)（ＰＤＩ）為０．４６２?（見(jiàn)表１），在０．０８－０．７之間，??證明體系分散度適中，檢測(cè)結(jié)果置信度高。??Ｓｉｚｅ?Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｂｙ?Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ??８ｔ?？：?：?：?：?：??ｃ????ｉ．?ｊＢｋ?．ｉ????１?１０?１００?１０００?１００００??Ｓｉｚｅ?（ｄ．ｎｍ）??圖４外泌體粒徑分布圖??縱坐標(biāo)表示各種大小外泌體所占外泌體總數(shù)的百分比，單位為％；橫坐標(biāo)表示外泌體直徑大??小，單位為ｎｍ。??表１：外泌體的粒徑分布??樣品?平均粒徑?分布系數(shù)?粒徑主峰?２０ｎｍ－２００ｎｍ??（ＰＤＩ）?＊?粒徑百分比??外泌體?３１．２５ｎｍ?０．４６２?６６．６３ｎｍ?７２．２％??＊分布系數(shù)（ＰＤＩ），根據(jù)累積距法得到，是一個(gè)無(wú)量綱的值，代表粒子尺寸的分??布：０．０８－０．７代表適中分散度體系，是運(yùn)算法則最佳適用范圍。??２８??

３．０外泌體表面特異性膜蛋白??從急性髓白血病細(xì)胞株ＨＬ－６０培養(yǎng)上清液提取的外泌體，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢??測(cè)，均表達(dá)ＣＤ６３、ＣＤ８１兩個(gè)外泌體特異性分子標(biāo)志物，結(jié)果如圖５：陽(yáng)性率分??別為８６．１％和９２．１％，進(jìn)一步證明了該提取物為外泌體。??ＮＣ?Ｃ０６３?ＣＤ８１??Ｇａｔｅ：?ＰＩ?Ｇａｔｅ：?ＰＩ?Ｇａｔｅ：Ｐｌ??ｎ?ＴＴｒＩ?Ｉ?Ｖ３－Ｒ?：ＴＴｉ?ｖＴｆＴ??ＪＯ?２％?ｌ?９?８％?１３?Ｓ＇：４?８６?１９％?９２?１％??Ｉ?Ｓ－?Ｉ?Ｓ?Ｌ??Ｊ§－?■?Ｊ§－?■?Ｊ§．?Ｉ，??ｃ?ｉｉｕｉｉ＇?７?（ｉｉｉｉｉ?ｉ?：！■（?ｃ?十ＴｎｉｆＴＴＴｒｔｌ＾一Ｉ?ｌｌｔｌｉｌ?Ｉ?ｉｉ＇ｉ．１１?Ｉ?ｋｎ?ｔａ?ｎＴＷ＾Ｈｌ＾ｉＭｗｒ?ｍｉ?ｎ?ｉｉｉ?■??．１?＾?＾?＾?ＫＳ?Ｋｂ?ＷＴ２?？，?ｙ?ｄ?？５?＃?＊７２?＾?＾?＜３?＾?？”??ＦＬ１Ａ?ＦＬ１．Ａ?ＦＬ１－Ａ??圖５外泌體特異性蛋白ＣＤ６３、ＣＤ８１的表達(dá)??縱坐標(biāo)為外泌體陽(yáng)性／陰性數(shù)目，橫坐標(biāo)為熒光檢測(cè)強(qiáng)度，紅色為標(biāo)準(zhǔn)線，標(biāo)準(zhǔn)線右側(cè)為陽(yáng)??性峰，蛋白ＣＤ６３表達(dá)陽(yáng)性率為８６．１％，?ＣＤ８１表達(dá)陽(yáng)性率為９２．１％。??３．２?ｍｉＲ－１５５在ＡＭＬ白血病細(xì)胞株中的表達(dá)水平??運(yùn)用ＲＴ－ｑＰＣＲ方法檢測(cè)ｍｉｒ－１５５在急性髓系白血病細(xì)胞ＴＨＰ－１和ＨＬ－６０中??的表達(dá)情況。結(jié)果可見(jiàn)（圖６），ｍｉＲ－１５５在ＴＨＰ－１和ＨＬ－６０兩種細(xì)胞中均有所??表達(dá)。與ＴＨＰ－１細(xì)胞比較
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本文編號(hào)：2892879