AML外泌體miR-155對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的影響及其機(jī)制的初步研究
【學(xué)位單位】:湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位年份】:2018
【中圖分類】:R733.71
【部分圖文】:
要的結(jié)構(gòu)蛋白、特異性酶、gag和pol基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。pHelper?2.0載體中??攜帶有單純皰瘆病毒來(lái)源的VSV-G基因,可以為病毒包裝提供所需要的包膜蛋??白。pHelper?1.0和pHelper?2.0病毒載體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。??y?1?-??圖1?miR-155過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)慢病毒載體結(jié)構(gòu)圖??A:?GV369?為?miR-155?過(guò)表達(dá)慢病毒載體,原件順序?Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin??B:?GV234為miR-155抑制表達(dá)慢病毒載體,原件順序?yàn)椋瑁眨叮停茫樱茫停郑牛牵疲??占I?Helperl?.0?!?\?〇/?Helper2.0?\??/\U3?R?昍??'??圖2?A為Helper?1.0病毒載體,B為Helper?2.0病毒載體??載體酶切:??按照下表順序依次加入各種試劑,配制反應(yīng)體系將載體進(jìn)行酶切。反應(yīng)體系??配制完成后,用移液槍小心抽吸混勻,輕微離心,37°C孵育過(guò)夜。將載體酶切??產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,并回收其目的條帶。??14??
3.1.2外泌體的粒徑大小??重懸后的外泌體樣品,通過(guò)ZETASIZER?Nano?series-Nano-ZS儀器進(jìn)行分析,??結(jié)果如圖4所示,檢測(cè)到的外泌體粒徑主峰為66.63nm,平均粒徑為31.25,其??中20nm-200nm范圍72.2%,平均粒徑以及粒徑主峰均與公認(rèn)的外泌體粒徑大小??吻合。且檢測(cè)得到的粒子分布系數(shù)(PDI)為0.462?(見(jiàn)表1),在0.08-0.7之間,??證明體系分散度適中,檢測(cè)結(jié)果置信度高。??Size?Distribution?by?Intensity??8t??:?:?:?:?:??c????i.?jBk?.i????1?10?100?1000?10000??Size?(d.nm)??圖4外泌體粒徑分布圖??縱坐標(biāo)表示各種大小外泌體所占外泌體總數(shù)的百分比,單位為%;橫坐標(biāo)表示外泌體直徑大??小,單位為nm。??表1:外泌體的粒徑分布??樣品?平均粒徑?分布系數(shù)?粒徑主峰?20nm-200nm??(PDI)?*?粒徑百分比??外泌體?31.25nm?0.462?66.63nm?72.2%??*分布系數(shù)(PDI),根據(jù)累積距法得到,是一個(gè)無(wú)量綱的值,代表粒子尺寸的分??布:0.08-0.7代表適中分散度體系,是運(yùn)算法則最佳適用范圍。??28??
3.0外泌體表面特異性膜蛋白??從急性髓白血病細(xì)胞株HL-60培養(yǎng)上清液提取的外泌體,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢??測(cè),均表達(dá)CD63、CD81兩個(gè)外泌體特異性分子標(biāo)志物,結(jié)果如圖5:陽(yáng)性率分??別為86.1%和92.1%,進(jìn)一步證明了該提取物為外泌體。??NC?C063?CD81??Gate:?PI?Gate:?PI?Gate:Pl??n?TTrI?I?V3-R?:TTi?vTfT??JO?2%?l?9?8%?13?S':4?86?19%?92?1%??I?S-?I?S?L??J§-?■?J§-?■?J§.?I,??c?iiuii'?7?(iiiii?i?:!■(?c?十TnifTTTrtl^一I?lltlil?I?ii'i.11?I?kn?ta?nTW^Hl^iMwr?mi?n?iii?■??.1?^?^?^?KS?Kb?WT2??,?y?d??5?#?*72?^?^?<3?^??”??FL1A?FL1.A?FL1-A??圖5外泌體特異性蛋白CD63、CD81的表達(dá)??縱坐標(biāo)為外泌體陽(yáng)性/陰性數(shù)目,橫坐標(biāo)為熒光檢測(cè)強(qiáng)度,紅色為標(biāo)準(zhǔn)線,標(biāo)準(zhǔn)線右側(cè)為陽(yáng)??性峰,蛋白CD63表達(dá)陽(yáng)性率為86.1%,?CD81表達(dá)陽(yáng)性率為92.1%。??3.2?miR-155在AML白血病細(xì)胞株中的表達(dá)水平??運(yùn)用RT-qPCR方法檢測(cè)mir-155在急性髓系白血病細(xì)胞THP-1和HL-60中??的表達(dá)情況。結(jié)果可見(jiàn)(圖6),miR-155在THP-1和HL-60兩種細(xì)胞中均有所??表達(dá)。與THP-1細(xì)胞比較
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