B細胞白血病和淋巴瘤是惡性血液病中最常見的亞型,復發(fā)/難治是臨床上導致治療失敗的主要原因,近1/3患者因此不治而亡。近五年來,可特異性識別B細胞表面CD19、CD19的嵌合抗原受體的T細胞(CART)在針對復發(fā)/難治B細胞淋巴瘤的臨床試驗中取得了非常顯著的療效,引發(fā)了全球范圍內(nèi)CART細胞的開發(fā)和利用狂潮。CAR結構主要由T細胞受體的胞外抗原結合區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)信號區(qū)三部分組成。目前國內(nèi)外大部分CD19-CART的臨床前和臨床試驗采用的是含有CD28或者4-1BB共刺激分子的二代CART技術。迄今為止全球范圍內(nèi)針對B細胞淋巴瘤/白血病的公開注冊的臨床試驗近80余個。然而,我國國內(nèi)所進行的抗CD19-CART細胞臨床治療的效果較國際水平有較大差距。主要原因在于CAR基因結構構造不夠理想,體外基因修飾技術不穩(wěn)定,臨床前CD19-CART免疫治療有效性和安全性研究數(shù)據(jù)不充分,因此規(guī)范CD19-CART臨床前細胞制備工藝,完善質(zhì)量控制體系,制備有效性和安全性的CD19-CART細胞產(chǎn)品對于規(guī)范CART細胞治療顯得尤為重要。由于CARs提供MHC非依賴性抗原識別,可以避免腫瘤細胞用于免疫逃逸的一些機制,例如MHC分子的下調(diào)等,其優(yōu)點主要是高效、靶向結合腫瘤相關抗原,激活特異性殺傷。Tomonori Tsukahara等的研究表明CART是否能在腫瘤部位快速歸巢并維持較高的濃度關系著CART免疫治療的成敗。CART細胞自身的數(shù)量和體內(nèi)分布情況決定著其在體內(nèi)能否與腫瘤抗原結合并將其清除。因此觀察和探索CART細胞在免疫治療過程的分布,歸巢和擴增情況,有助于完善CART細胞腫瘤免疫治療。目前全球范圍內(nèi)關于抗CD19-CART細胞免疫治療的Ⅰ期臨床試驗在治療復發(fā)或難治的B細胞急性白血病、慢性白血病、淋巴瘤取得了顯著的療效。但是仍有部分患者在應用抗CD19-CART細胞免疫治療后未取得緩解或者緩解后再復發(fā)。因此優(yōu)化CART的治療在臨床上顯得尤為重要。目前國內(nèi)外大部分關于CD19-CART的臨床試驗均未對T細胞進行分選。因此臨床試驗中每位患者輸注的CD19-CART的亞型組成均不相同。這種亞型組成差異將導致不同患者之間CD19-CART治療效果的差異,從面臨床上每位患者接受的CD19-CART免疫治療難以實現(xiàn)標準化。Fred Hutchinson腫瘤研究中心Daniel Sommermeyer等的研究首次將CD19-CART進行分選,研究了 T細胞不同亞型之間的功能差異,證實了 CD4+和CD8+T細胞在CD19-CART抗腫瘤發(fā)揮著不同但相互依存的作用。CD8+T細胞主要負責殺傷和清除腫瘤細胞的作用,起到主要的抗腫瘤免疫作用,CD4+T細胞主要負責分泌細胞因子,促進CD8+T增殖,起到輔助CD8+T細胞對腫瘤的殺傷的作用,CD8+T細胞和CD4+T細胞在CD19-CART免疫治療過程中起到互相促進,相互依賴的作用,二者缺一不可,但其研究中并未明確CD4+和CD8+T細胞的最佳比例和有效劑量。同時該研究中進一步將CD4和CD8分為原始T細胞(TN)、效應T細胞(TE)、中心記憶T細胞(TCM)、效應記憶T細胞(TEM),探索其在CART免疫治療過程中發(fā)揮的不同作用,這種方法在CART臨床培養(yǎng)和臨床應用中基本無法實現(xiàn)。因此探索CD4+和CD8+T細胞的最佳比例和臨床有效劑量顯得十分必要。研究目的:構建CD19-CART體外擴增體系,評估其安全性和有效性。觀察CD19-CART細胞回輸后體內(nèi)的分布、歸巢、擴增情況。同時探索CD4+和CD8+T細胞在CD19-CART免疫治療過程中扮演的角色和最佳組合比例以及CD4+和CD8+T細胞的有效劑量。從而優(yōu)化CD19-CART免疫治療,實現(xiàn)CD19-CART細胞免疫臨床治療的標準化和國際化。研究方法:第一部分:我們構建了 CD19-CART四質(zhì)粒慢病毒表達載體,確立CD19-CART體外培養(yǎng)擴增體系,通過體外細胞殺傷實驗和體內(nèi)動物試驗評估CD19-CART細胞免疫治療的有效性和安全性。第二部分:我們采用熒光標記構建CD19-Fluc-CART示蹤細胞,通過體內(nèi)動物實驗觀察CD19-CART回輸體內(nèi)后的分布、歸巢、擴增情況。第三部分:采用免疫磁珠陽性分選的方法將外周血單核細胞(PBMC)分選為CD4+和CD8+T細胞,然后采用慢病毒轉(zhuǎn)染方法分別構建CD4+CD19-CART細胞和CD8+CD19-CART 細胞,然后將其按照不同 CD4/8 比例(CD4,CD4/8:3:1,1:1,1:3,CD8)進行組合,通過體外和體內(nèi)細胞殺傷實驗觀察CD4+和CD8+T細胞扮演的角色和最佳比例。第四部分:基于第三部分實驗,我們發(fā)現(xiàn)CD8+CD19-CART細胞主要負責早期殺傷和清除腫瘤腫瘤細胞的作用,其早期完全清除腫瘤對于CD19-CART免疫治療十分關鍵,因此我們選擇了三種不同劑量的CD8+CD19-CART分別為:低劑量組(2×106)、中劑量組(5×106)、高劑量組(1X107),通過體內(nèi)殺傷實驗觀察能夠完全清除腫瘤細胞的最低CD8+CD19-CART有效劑量。CD4+CD19-CART主要負責分泌細胞因子,促進激活腫瘤免疫殺傷,對于維持CART免疫治療后期維持CD8+CD19-CART有效殺傷和預防腫瘤復發(fā)起到重要作用,因此確定CD8+CD19-CART有效劑量后,我們固定CD8+CD19-CART劑量,通過體內(nèi)動物實驗觀察不同劑量CD4+CD19-CART和CD8+CD19-CART混合后的殺傷情況,從而確定CD4+CD19-CART的有效劑量。研究結果:1.成功構建了 CD19-CART體外擴增培養(yǎng)體系,體外細胞實驗和體內(nèi)動物殺傷實驗結果表明構建的CD19-CART能夠有效的殺傷CD19腫瘤抗原表達陽性的細胞。且CD19-CART高劑量組體內(nèi)殺傷效果好于CD19-CART低劑量組。2.在小鼠CD19抗原陽性淋巴瘤模型內(nèi),CD19-CART回輸體內(nèi)后能夠快速的歸巢,與腫瘤抗原結合,并能在小鼠體內(nèi)長期的存活。形成免疫監(jiān)視和免疫記憶。3.不同CD4/8比例體外殺傷實驗結果表明:CD8+CD19-CART主要負責直接殺傷腫瘤細胞,CD4+CD19-CART細胞主要負責分泌細胞因子(人源IL-2,IL-10,IFN-γand TNF-α)。體內(nèi)動物實驗結果表明CD4/8 1:1,1:3組兩組小鼠的生存期最長。CD8+CD19-CART早期完全清除腫瘤十分重要。CD8+CD19-CART劑量不足,早期不能完全清除腫瘤細胞,腫瘤很快復發(fā)。CD4+CD19-CART負責輔助CD8+CD19-CART殺傷腫瘤細胞,如果缺乏CD4+CD19-CART,即使早期完全清除腫瘤細胞,腫瘤也終將復發(fā)。4.CD8+CD19-CART不同劑量組體內(nèi)細胞殺傷實驗結果表明:中劑量組(5 × 106)和高劑量組(1× 107)早期完全清除腫瘤細胞,而低劑量組(2×106)早期未能完全清除腫瘤細胞,腫瘤很快復發(fā)。因此CD8+CD19-CART有效劑量確定為:中劑量組(5×106)。固定CD8+CD19-CART有效劑量后,我們發(fā)現(xiàn)CD4+CD19-CART劑量至少為CD8+CD19-CART有效劑量的1/3,才能保證CART免疫治療的遠期殺傷效果,NPG淋巴瘤小鼠能長期無復發(fā)生存。研究結論:1、采用4-1BB共刺激分子的二代CAR設計,四質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染構建CD19-CART體外培養(yǎng)體系能夠保證CD19-CART免疫治療的安全性和有效性,與目前國際最新CD 19-CART臨床試驗和臨床前試驗保持一致。2、CART的靶向歸巢能力和體內(nèi)存活時間和數(shù)量對于CD19-CART體內(nèi)殺傷效果和免疫治療效果至關重要。3、CART分選可以優(yōu)化臨床CD19-CART免疫治療,按照CD4 CD19-CART和CD8 CD19-CART有效劑量進行輸注可以最大限度保證CD19-CART臨床治療效果。避免不同患者之間因T細胞子集比例不同造成的治療效果的差異。使不同中心間的臨床試驗的結果方便比較,綜合,進行大數(shù)據(jù)分析。4、CART標準化治療是未來CART領域的發(fā)展方向,因此CART分選的研究顯得十分重要,但仍需大規(guī)模臨床試驗結果的進一步驗證。
【學位單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R733
【部分圖文】：

１．３．２?ＣＤ１９－ＣＡＲＴ擴增培養(yǎng)體系的建立??從健康成人外周血收集ＰＢＭＣ，通過擴增、轉(zhuǎn)導等程序，我們成功合成了??ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞，然后將ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞在體外進行擴增。如圖１－２Ａ所示，經(jīng)過??１２天的體外培養(yǎng)，兩組Ｔ細胞數(shù)量呈指數(shù)上升。同時，如圖１－２Ｂ所示，未轉(zhuǎn)染組Ｔ??細胞和ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞組的細胞活率在培養(yǎng)周期中一直維持在５０％以上，且隨著培??養(yǎng)時間的延長，兩組細胞活率都有明顯的升高。在Ｄ１２天收獲時均達到９０％??２１??

１．３．３?ＣＤ１９－ＣＡＲ在Ｔ細胞表面的表達效率??體外條件下成功合成和擴增ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞的同時，我們還對ＣＡＲ轉(zhuǎn)導效率??進行了分析，以觀察合成的ＣＡＲＴ細胞的轉(zhuǎn)導效率。如圖１－３所示，未轉(zhuǎn)染組的Ｔ??細胞表面ＣＡＲ分子表達陽性率極低，而與之相比，ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞表面的ＣＡＲ分??子表達陽性率明顯升高，達到４４．２％。ＣＡＲ分子的表達率在ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞組中明??顯高于未轉(zhuǎn)染組，差異具有統(tǒng)計學意義（ｐ＜０．０１）。??Ａ?未轉(zhuǎn)染組?Ｂ?ＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ??１?ｄＱ６－ＵＬ?Ｑ６－ＵＲＩ?＾?ｄ〇６－ＵＬ?Ｑ６－ＵＲ??－０．１％?００％?－０．１％?０．１％??１畫??，－－?０．１％?，?４４．２％??”?＊１?｜??？?ｙｐ?＾?〇?Ｓ？２?ｍ３?＊，４．７??ＣＤ１９?ＣＡＲ?ＣＤ１９?ＣＡＲ??圖１－３．?ＣＤ１９－ＣＡＲ在Ｔ細胞表面的表達效率。（Ａ）未轉(zhuǎn)染組ＣＡＲ分子在Ｔ細胞表面的陽性表??達效率；（Ｂ）?ＣＤ１９－ＣＡＲＴ組ＣＡＲ分子在Ｔ細胞表面的陽性表達效率。??２２??

培養(yǎng)時間（天）?培養(yǎng)時間（天〉??圖１－２．?ＣＤ１９－ＣＡＲＴ培養(yǎng)過程中未轉(zhuǎn)染組和ＣＤ１９－ＣＡＲＴ組細胞數(shù)量和細胞活率變化情況。（Ａ）??ＣＤ１９－ＣＡＲＴ培養(yǎng)過程中兩組細胞數(shù)量變化情況；（Ｂ）?ＣＤ１９－ＣＡＲＴ培養(yǎng)過程中兩組細胞細胞活??率變化情況。??１．３．３?ＣＤ１９－ＣＡＲ在Ｔ細胞表面的表達效率??體外條件下成功合成和擴增ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞的同時，我們還對ＣＡＲ轉(zhuǎn)導效率??進行了分析，以觀察合成的ＣＡＲＴ細胞的轉(zhuǎn)導效率。如圖１－３所示，未轉(zhuǎn)染組的Ｔ??細胞表面ＣＡＲ分子表達陽性率極低，而與之相比，ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞表面的ＣＡＲ分??子表達陽性率明顯升高，達到４４．２％。ＣＡＲ分子的表達率在ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞組中明??顯高于未轉(zhuǎn)染組，差異具有統(tǒng)計學意義（ｐ＜０．０１）。??Ａ?未轉(zhuǎn)染組?Ｂ?ＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ??１?ｄＱ６－ＵＬ?Ｑ６－ＵＲＩ?＾?ｄ〇６－ＵＬ?Ｑ６－ＵＲ??－０．１％?００％?－０．１％?０．１％??１畫??，－－?０．１％?，?４４．２％??”?＊１?｜??？?ｙｐ?＾?〇?Ｓ？２?ｍ３?＊
【相似文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 李鵬;CD19-CART治療B細胞血液惡性腫瘤的臨床前研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2018年

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1 許倩倩;BMS-345541與CD19-CART聯(lián)合及序貫給藥對CD19~+腫瘤細胞的影響[D];福建醫(yī)科大學;2016年

本文編號：2892452