發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 03:27

　　 B細(xì)胞白血病和淋巴瘤是惡性血液病中最常見的亞型,復(fù)發(fā)/難治是臨床上導(dǎo)致治療失敗的主要原因,近1/3患者因此不治而亡。近五年來,可特異性識(shí)別B細(xì)胞表面CD19、CD19的嵌合抗原受體的T細(xì)胞(CART)在針對(duì)復(fù)發(fā)/難治B細(xì)胞淋巴瘤的臨床試驗(yàn)中取得了非常顯著的療效,引發(fā)了全球范圍內(nèi)CART細(xì)胞的開發(fā)和利用狂潮。CAR結(jié)構(gòu)主要由T細(xì)胞受體的胞外抗原結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)信號(hào)區(qū)三部分組成。目前國(guó)內(nèi)外大部分CD19-CART的臨床前和臨床試驗(yàn)采用的是含有CD28或者4-1BB共刺激分子的二代CART技術(shù)。迄今為止全球范圍內(nèi)針對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病的公開注冊(cè)的臨床試驗(yàn)近80余個(gè)。然而,我國(guó)國(guó)內(nèi)所進(jìn)行的抗CD19-CART細(xì)胞臨床治療的效果較國(guó)際水平有較大差距。主要原因在于CAR基因結(jié)構(gòu)構(gòu)造不夠理想,體外基因修飾技術(shù)不穩(wěn)定,臨床前CD19-CART免疫治療有效性和安全性研究數(shù)據(jù)不充分,因此規(guī)范CD19-CART臨床前細(xì)胞制備工藝,完善質(zhì)量控制體系,制備有效性和安全性的CD19-CART細(xì)胞產(chǎn)品對(duì)于規(guī)范CART細(xì)胞治療顯得尤為重要。由于CARs提供MHC非依賴性抗原識(shí)別,可以避免腫瘤細(xì)胞用于免疫逃逸的一些機(jī)制,例如MHC分子的下調(diào)等,其優(yōu)點(diǎn)主要是高效、靶向結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原,激活特異性殺傷。Tomonori Tsukahara等的研究表明CART是否能在腫瘤部位快速歸巢并維持較高的濃度關(guān)系著CART免疫治療的成敗。CART細(xì)胞自身的數(shù)量和體內(nèi)分布情況決定著其在體內(nèi)能否與腫瘤抗原結(jié)合并將其清除。因此觀察和探索CART細(xì)胞在免疫治療過程的分布,歸巢和擴(kuò)增情況,有助于完善CART細(xì)胞腫瘤免疫治療。目前全球范圍內(nèi)關(guān)于抗CD19-CART細(xì)胞免疫治療的Ⅰ期臨床試驗(yàn)在治療復(fù)發(fā)或難治的B細(xì)胞急性白血病、慢性白血病、淋巴瘤取得了顯著的療效。但是仍有部分患者在應(yīng)用抗CD19-CART細(xì)胞免疫治療后未取得緩解或者緩解后再?gòu)?fù)發(fā)。因此優(yōu)化CART的治療在臨床上顯得尤為重要。目前國(guó)內(nèi)外大部分關(guān)于CD19-CART的臨床試驗(yàn)均未對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行分選。因此臨床試驗(yàn)中每位患者輸注的CD19-CART的亞型組成均不相同。這種亞型組成差異將導(dǎo)致不同患者之間CD19-CART治療效果的差異,從面臨床上每位患者接受的CD19-CART免疫治療難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。Fred Hutchinson腫瘤研究中心Daniel Sommermeyer等的研究首次將CD19-CART進(jìn)行分選,研究了 T細(xì)胞不同亞型之間的功能差異,證實(shí)了 CD4+和CD8+T細(xì)胞在CD19-CART抗腫瘤發(fā)揮著不同但相互依存的作用。CD8+T細(xì)胞主要負(fù)責(zé)殺傷和清除腫瘤細(xì)胞的作用,起到主要的抗腫瘤免疫作用,CD4+T細(xì)胞主要負(fù)責(zé)分泌細(xì)胞因子,促進(jìn)CD8+T增殖,起到輔助CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷的作用,CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞在CD19-CART免疫治療過程中起到互相促進(jìn),相互依賴的作用,二者缺一不可,但其研究中并未明確CD4+和CD8+T細(xì)胞的最佳比例和有效劑量。同時(shí)該研究中進(jìn)一步將CD4和CD8分為原始T細(xì)胞(TN)、效應(yīng)T細(xì)胞(TE)、中心記憶T細(xì)胞(TCM)、效應(yīng)記憶T細(xì)胞(TEM),探索其在CART免疫治療過程中發(fā)揮的不同作用,這種方法在CART臨床培養(yǎng)和臨床應(yīng)用中基本無法實(shí)現(xiàn)。因此探索CD4+和CD8+T細(xì)胞的最佳比例和臨床有效劑量顯得十分必要。研究目的:構(gòu)建CD19-CART體外擴(kuò)增體系,評(píng)估其安全性和有效性。觀察CD19-CART細(xì)胞回輸后體內(nèi)的分布、歸巢、擴(kuò)增情況。同時(shí)探索CD4+和CD8+T細(xì)胞在CD19-CART免疫治療過程中扮演的角色和最佳組合比例以及CD4+和CD8+T細(xì)胞的有效劑量。從而優(yōu)化CD19-CART免疫治療,實(shí)現(xiàn)CD19-CART細(xì)胞免疫臨床治療的標(biāo)準(zhǔn)化和國(guó)際化。研究方法:第一部分:我們構(gòu)建了 CD19-CART四質(zhì)粒慢病毒表達(dá)載體,確立CD19-CART體外培養(yǎng)擴(kuò)增體系,通過體外細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)估CD19-CART細(xì)胞免疫治療的有效性和安全性。第二部分:我們采用熒光標(biāo)記構(gòu)建CD19-Fluc-CART示蹤細(xì)胞,通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察CD19-CART回輸體內(nèi)后的分布、歸巢、擴(kuò)增情況。第三部分:采用免疫磁珠陽(yáng)性分選的方法將外周血單核細(xì)胞(PBMC)分選為CD4+和CD8+T細(xì)胞,然后采用慢病毒轉(zhuǎn)染方法分別構(gòu)建CD4+CD19-CART細(xì)胞和CD8+CD19-CART 細(xì)胞,然后將其按照不同 CD4/8 比例(CD4,CD4/8:3:1,1:1,1:3,CD8)進(jìn)行組合,通過體外和體內(nèi)細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)觀察CD4+和CD8+T細(xì)胞扮演的角色和最佳比例。第四部分:基于第三部分實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)CD8+CD19-CART細(xì)胞主要負(fù)責(zé)早期殺傷和清除腫瘤腫瘤細(xì)胞的作用,其早期完全清除腫瘤對(duì)于CD19-CART免疫治療十分關(guān)鍵,因此我們選擇了三種不同劑量的CD8+CD19-CART分別為:低劑量組(2×106)、中劑量組(5×106)、高劑量組(1X107),通過體內(nèi)殺傷實(shí)驗(yàn)觀察能夠完全清除腫瘤細(xì)胞的最低CD8+CD19-CART有效劑量。CD4+CD19-CART主要負(fù)責(zé)分泌細(xì)胞因子,促進(jìn)激活腫瘤免疫殺傷,對(duì)于維持CART免疫治療后期維持CD8+CD19-CART有效殺傷和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)起到重要作用,因此確定CD8+CD19-CART有效劑量后,我們固定CD8+CD19-CART劑量,通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量CD4+CD19-CART和CD8+CD19-CART混合后的殺傷情況,從而確定CD4+CD19-CART的有效劑量。研究結(jié)果:1.成功構(gòu)建了 CD19-CART體外擴(kuò)增培養(yǎng)體系,體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明構(gòu)建的CD19-CART能夠有效的殺傷CD19腫瘤抗原表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞。且CD19-CART高劑量組體內(nèi)殺傷效果好于CD19-CART低劑量組。2.在小鼠CD19抗原陽(yáng)性淋巴瘤模型內(nèi),CD19-CART回輸體內(nèi)后能夠快速的歸巢,與腫瘤抗原結(jié)合,并能在小鼠體內(nèi)長(zhǎng)期的存活。形成免疫監(jiān)視和免疫記憶。3.不同CD4/8比例體外殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:CD8+CD19-CART主要負(fù)責(zé)直接殺傷腫瘤細(xì)胞,CD4+CD19-CART細(xì)胞主要負(fù)責(zé)分泌細(xì)胞因子(人源IL-2,IL-10,IFN-γand TNF-α)。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CD4/8 1:1,1:3組兩組小鼠的生存期最長(zhǎng)。CD8+CD19-CART早期完全清除腫瘤十分重要。CD8+CD19-CART劑量不足,早期不能完全清除腫瘤細(xì)胞,腫瘤很快復(fù)發(fā)。CD4+CD19-CART負(fù)責(zé)輔助CD8+CD19-CART殺傷腫瘤細(xì)胞,如果缺乏CD4+CD19-CART,即使早期完全清除腫瘤細(xì)胞,腫瘤也終將復(fù)發(fā)。4.CD8+CD19-CART不同劑量組體內(nèi)細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:中劑量組(5 × 106)和高劑量組(1× 107)早期完全清除腫瘤細(xì)胞,而低劑量組(2×106)早期未能完全清除腫瘤細(xì)胞,腫瘤很快復(fù)發(fā)。因此CD8+CD19-CART有效劑量確定為:中劑量組(5×106)。固定CD8+CD19-CART有效劑量后,我們發(fā)現(xiàn)CD4+CD19-CART劑量至少為CD8+CD19-CART有效劑量的1/3,才能保證CART免疫治療的遠(yuǎn)期殺傷效果,NPG淋巴瘤小鼠能長(zhǎng)期無復(fù)發(fā)生存。研究結(jié)論:1、采用4-1BB共刺激分子的二代CAR設(shè)計(jì),四質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建CD19-CART體外培養(yǎng)體系能夠保證CD19-CART免疫治療的安全性和有效性,與目前國(guó)際最新CD 19-CART臨床試驗(yàn)和臨床前試驗(yàn)保持一致。2、CART的靶向歸巢能力和體內(nèi)存活時(shí)間和數(shù)量對(duì)于CD19-CART體內(nèi)殺傷效果和免疫治療效果至關(guān)重要。3、CART分選可以優(yōu)化臨床CD19-CART免疫治療,按照CD4 CD19-CART和CD8 CD19-CART有效劑量進(jìn)行輸注可以最大限度保證CD19-CART臨床治療效果。避免不同患者之間因T細(xì)胞子集比例不同造成的治療效果的差異。使不同中心間的臨床試驗(yàn)的結(jié)果方便比較,綜合,進(jìn)行大數(shù)據(jù)分析。4、CART標(biāo)準(zhǔn)化治療是未來CART領(lǐng)域的發(fā)展方向,因此CART分選的研究顯得十分重要,但仍需大規(guī)模臨床試驗(yàn)結(jié)果的進(jìn)一步驗(yàn)證。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R733
【部分圖文】：

１．３．２?ＣＤ１９－ＣＡＲＴ擴(kuò)增培養(yǎng)體系的建立??從健康成人外周血收集ＰＢＭＣ，通過擴(kuò)增、轉(zhuǎn)導(dǎo)等程序，我們成功合成了??ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細(xì)胞，然后將ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細(xì)胞在體外進(jìn)行擴(kuò)增。如圖１－２Ａ所示，經(jīng)過??１２天的體外培養(yǎng)，兩組Ｔ細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)上升。同時(shí)，如圖１－２Ｂ所示，未轉(zhuǎn)染組Ｔ??細(xì)胞和ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細(xì)胞組的細(xì)胞活率在培養(yǎng)周期中一直維持在５０％以上，且隨著培??養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組細(xì)胞活率都有明顯的升高。在Ｄ１２天收獲時(shí)均達(dá)到９０％??２１??

１．３．３?ＣＤ１９－ＣＡＲ在Ｔ細(xì)胞表面的表達(dá)效率??體外條件下成功合成和擴(kuò)增ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細(xì)胞的同時(shí)，我們還對(duì)ＣＡＲ轉(zhuǎn)導(dǎo)效率??進(jìn)行了分析，以觀察合成的ＣＡＲＴ細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。如圖１－３所示，未轉(zhuǎn)染組的Ｔ??細(xì)胞表面ＣＡＲ分子表達(dá)陽(yáng)性率極低，而與之相比，ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細(xì)胞表面的ＣＡＲ分??子表達(dá)陽(yáng)性率明顯升高，達(dá)到４４．２％。ＣＡＲ分子的表達(dá)率在ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細(xì)胞組中明??顯高于未轉(zhuǎn)染組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｐ＜０．０１）。??Ａ?未轉(zhuǎn)染組?Ｂ?ＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ??１?ｄＱ６－ＵＬ?Ｑ６－ＵＲＩ?＾?ｄ〇６－ＵＬ?Ｑ６－ＵＲ??－０．１％?００％?－０．１％?０．１％??１畫??，－－?０．１％?，?４４．２％??”?＊１?｜??？?ｙｐ?＾?〇?Ｓ？２?ｍ３?＊，４．７??ＣＤ１９?ＣＡＲ?ＣＤ１９?ＣＡＲ??圖１－３．?ＣＤ１９－ＣＡＲ在Ｔ細(xì)胞表面的表達(dá)效率。（Ａ）未轉(zhuǎn)染組ＣＡＲ分子在Ｔ細(xì)胞表面的陽(yáng)性表??達(dá)效率；（Ｂ）?ＣＤ１９－ＣＡＲＴ組ＣＡＲ分子在Ｔ細(xì)胞表面的陽(yáng)性表達(dá)效率。??２２??

培養(yǎng)時(shí)間（天）?培養(yǎng)時(shí)間（天〉??圖１－２．?ＣＤ１９－ＣＡＲＴ培養(yǎng)過程中未轉(zhuǎn)染組和ＣＤ１９－ＣＡＲＴ組細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活率變化情況。（Ａ）??ＣＤ１９－ＣＡＲＴ培養(yǎng)過程中兩組細(xì)胞數(shù)量變化情況；（Ｂ）?ＣＤ１９－ＣＡＲＴ培養(yǎng)過程中兩組細(xì)胞細(xì)胞活??率變化情況。??１．３．３?ＣＤ１９－ＣＡＲ在Ｔ細(xì)胞表面的表達(dá)效率??體外條件下成功合成和擴(kuò)增ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細(xì)胞的同時(shí)，我們還對(duì)ＣＡＲ轉(zhuǎn)導(dǎo)效率??進(jìn)行了分析，以觀察合成的ＣＡＲＴ細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。如圖１－３所示，未轉(zhuǎn)染組的Ｔ??細(xì)胞表面ＣＡＲ分子表達(dá)陽(yáng)性率極低，而與之相比，ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細(xì)胞表面的ＣＡＲ分??子表達(dá)陽(yáng)性率明顯升高，達(dá)到４４．２％。ＣＡＲ分子的表達(dá)率在ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細(xì)胞組中明??顯高于未轉(zhuǎn)染組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｐ＜０．０１）。??Ａ?未轉(zhuǎn)染組?Ｂ?ＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ??１?ｄＱ６－ＵＬ?Ｑ６－ＵＲＩ?＾?ｄ〇６－ＵＬ?Ｑ６－ＵＲ??－０．１％?００％?－０．１％?０．１％??１畫??，－－?０．１％?，?４４．２％??”?＊１?｜??？?ｙｐ?＾?〇?Ｓ？２?ｍ３?＊
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本文編號(hào)：2892452