細胞是一個包涵了核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的有機整體。人類細胞含有大約1萬5千種蛋白質(zhì),它們在細胞生命發(fā)展的過程中發(fā)揮著重要作用。從蛋白質(zhì)的合成到降解受到各種系統(tǒng)的嚴格調(diào)控。約30%新合成的蛋白半衰期小于10分鐘。在這種快速降解的過程中,需要高效的蛋白酶系統(tǒng)發(fā)揮作用,泛素蛋白酶體系統(tǒng)作為蛋白降解的重要途徑,可以降解80%細胞內(nèi)不需要的蛋白,其功能包括降解錯誤折疊以及損傷蛋白、細胞周期調(diào)控因子、致癌基因以及腫瘤抑制因子,調(diào)控抗原呈遞以及轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控等。近年來,UPS(Ubiquitin Proteasome System)作為腫瘤治療的靶標受到了廣泛的關(guān)注。USP18(Ubiquitin Specific Protease 18)是UPS的一員,屬于DUBs(Deubiquitinases)家族。就目前來看USP18主要包括以下幾種功能:1、在CD11b~+DCs(Cluster of Differentiation 11b~+Dendritic Cells)和TH17(T helper cell17)細胞的發(fā)育過程中發(fā)揮作用。2、作為UPS成員之一,發(fā)揮類去泛素化功能將ISG15(Interferon-stimulated gene 15)從底物上水解下來,抑制Ⅰ型干擾素通路。3、在抑制Ⅰ型干擾素通路后增強病毒復(fù)制能力,以利于啟動適應(yīng)性免疫。4、在MCF-7以及白細胞中,缺陷型細胞增殖受阻并且發(fā)生凋亡,或者通過抑制Ⅰ型干擾素通路或者加快細胞增殖。在這種多向的作用關(guān)系下,我們對于USP18在部分乳腺癌細胞中的作用進行了初步探討。實驗室前期工作中,我們采用CRISPR/Cas9(Clustered regulary interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)系統(tǒng)在MDAMB231乳腺癌細胞中篩選與細胞增殖有關(guān)的基因。篩選發(fā)現(xiàn)USP18對MDAMB231細胞的增殖有影響。為了進一步了解其作用,我們首先在數(shù)據(jù)庫中進行挖掘,豎向分析發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細胞USP18的mRNA(messenger RNA)轉(zhuǎn)錄水平相對于正常組織是過量的。在橫向分析中,乳腺癌患者中USP18表達量較高的組別通常有較差的總生存期、無病生存期以及無遠處轉(zhuǎn)移生存期,因此我們認為USP18的表達量與乳腺癌有著很大的關(guān)系。接著我們采用shRNA(short hair-pin RNA)以及CRISPR/Cas9技術(shù)在乳腺癌細胞中敲低USP18,通過克隆形成實驗以及細胞MTS實驗結(jié)果觀察到敲低組的腫瘤細胞增殖減慢,過表達USP18細胞增殖加快,過表達回復(fù)證明腫瘤細胞增殖改變的原因為USP18。同時我們對USP18在細胞中的定位進行研究發(fā)現(xiàn)其主要定位于細胞質(zhì)。接下來我們通過周期實驗發(fā)現(xiàn)USP18可以顯著影響腫瘤細胞的周期并且導(dǎo)致細胞凋亡和衰老。我們發(fā)現(xiàn)敲低USP18抑制乳腺癌細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡以及衰老。
【學位單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737.9
【部分圖文】：

列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程，是生物體在進化中抵突變引起基因組不穩(wěn)定性的保護機制。當細胞中導(dǎo)入的雙鏈 RNA 時，該 mRNA 發(fā)生降解而達到基因表達默。在細胞質(zhì)中，雙鏈 RNA 首先被 Dicer 酶切割這些小片段招募核酸復(fù)合物形成 RNA 誘導(dǎo)的沉默ilencing complex）。在 ATP 的存在下，RISC 中的 siA中的反義鏈為模板，根據(jù)堿基配對原理結(jié)合到靶標s 的 5'端約 10nt 出切斷 mRNA，從而達到 RNAi 的容易被 RNA 酶降解發(fā)揮作用時間有限，在實際應(yīng)用n RNAs）即為段發(fā)夾 RNA，shRNA 具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)乳動物細胞中能夠長期甚至永久發(fā)揮 RNAi 作用。毒治療抗腫瘤治療中都有很好的應(yīng)用。

研究思維路線圖

掘多種腫瘤細胞過表達個數(shù)據(jù)庫中進行數(shù)據(jù)挖掘，首先通過在線數(shù)據(jù)庫對多表達量的比較。在篩選條件限制時，我們將分析類型比較，數(shù)據(jù)來自于公共數(shù)據(jù)庫，分析數(shù)據(jù)類型為來 3 可以看到與正常細胞相比多種腫瘤細胞中 USP18在大腦與中樞系統(tǒng)腫瘤細胞以及乳腺癌腫瘤細胞中。相關(guān)（圖 3 紅色代表相對高表達，藍色代表相對低
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本文編號：2892379