細(xì)胞是一個(gè)包涵了核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的有機(jī)整體。人類細(xì)胞含有大約1萬(wàn)5千種蛋白質(zhì),它們?cè)诩?xì)胞生命發(fā)展的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。從蛋白質(zhì)的合成到降解受到各種系統(tǒng)的嚴(yán)格調(diào)控。約30%新合成的蛋白半衰期小于10分鐘。在這種快速降解的過(guò)程中,需要高效的蛋白酶系統(tǒng)發(fā)揮作用,泛素蛋白酶體系統(tǒng)作為蛋白降解的重要途徑,可以降解80%細(xì)胞內(nèi)不需要的蛋白,其功能包括降解錯(cuò)誤折疊以及損傷蛋白、細(xì)胞周期調(diào)控因子、致癌基因以及腫瘤抑制因子,調(diào)控抗原呈遞以及轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控等。近年來(lái),UPS(Ubiquitin Proteasome System)作為腫瘤治療的靶標(biāo)受到了廣泛的關(guān)注。USP18(Ubiquitin Specific Protease 18)是UPS的一員,屬于DUBs(Deubiquitinases)家族。就目前來(lái)看USP18主要包括以下幾種功能:1、在CD11b~+DCs(Cluster of Differentiation 11b~+Dendritic Cells)和TH17(T helper cell17)細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。2、作為UPS成員之一,發(fā)揮類去泛素化功能將ISG15(Interferon-stimulated gene 15)從底物上水解下來(lái),抑制Ⅰ型干擾素通路。3、在抑制Ⅰ型干擾素通路后增強(qiáng)病毒復(fù)制能力,以利于啟動(dòng)適應(yīng)性免疫。4、在MCF-7以及白細(xì)胞中,缺陷型細(xì)胞增殖受阻并且發(fā)生凋亡,或者通過(guò)抑制Ⅰ型干擾素通路或者加快細(xì)胞增殖。在這種多向的作用關(guān)系下,我們對(duì)于USP18在部分乳腺癌細(xì)胞中的作用進(jìn)行了初步探討。實(shí)驗(yàn)室前期工作中,我們采用CRISPR/Cas9(Clustered regulary interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)系統(tǒng)在MDAMB231乳腺癌細(xì)胞中篩選與細(xì)胞增殖有關(guān)的基因。篩選發(fā)現(xiàn)USP18對(duì)MDAMB231細(xì)胞的增殖有影響。為了進(jìn)一步了解其作用,我們首先在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行挖掘,豎向分析發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞USP18的mRNA(messenger RNA)轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)于正常組織是過(guò)量的。在橫向分析中,乳腺癌患者中USP18表達(dá)量較高的組別通常有較差的總生存期、無(wú)病生存期以及無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期,因此我們認(rèn)為USP18的表達(dá)量與乳腺癌有著很大的關(guān)系。接著我們采用shRNA(short hair-pin RNA)以及CRISPR/Cas9技術(shù)在乳腺癌細(xì)胞中敲低USP18,通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到敲低組的腫瘤細(xì)胞增殖減慢,過(guò)表達(dá)USP18細(xì)胞增殖加快,過(guò)表達(dá)回復(fù)證明腫瘤細(xì)胞增殖改變的原因?yàn)閁SP18。同時(shí)我們對(duì)USP18在細(xì)胞中的定位進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其主要定位于細(xì)胞質(zhì)。接下來(lái)我們通過(guò)周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)USP18可以顯著影響腫瘤細(xì)胞的周期并且導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和衰老。我們發(fā)現(xiàn)敲低USP18抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及衰老。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.9
【部分圖文】：

列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過(guò)程，是生物體在進(jìn)化中抵突變引起基因組不穩(wěn)定性的保護(hù)機(jī)制。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入的雙鏈 RNA 時(shí)，該 mRNA 發(fā)生降解而達(dá)到基因表達(dá)默。在細(xì)胞質(zhì)中，雙鏈 RNA 首先被 Dicer 酶切割這些小片段招募核酸復(fù)合物形成 RNA 誘導(dǎo)的沉默ilencing complex）。在 ATP 的存在下，RISC 中的 siA中的反義鏈為模板，根據(jù)堿基配對(duì)原理結(jié)合到靶標(biāo)s 的 5'端約 10nt 出切斷 mRNA，從而達(dá)到 RNAi 的容易被 RNA 酶降解發(fā)揮作用時(shí)間有限，在實(shí)際應(yīng)用n RNAs）即為段發(fā)夾 RNA，shRNA 具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)乳動(dòng)物細(xì)胞中能夠長(zhǎng)期甚至永久發(fā)揮 RNAi 作用。毒治療抗腫瘤治療中都有很好的應(yīng)用。

研究思維路線圖

掘多種腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，首先通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)多表達(dá)量的比較。在篩選條件限制時(shí)，我們將分析類型比較，數(shù)據(jù)來(lái)自于公共數(shù)據(jù)庫(kù)，分析數(shù)據(jù)類型為來(lái) 3 可以看到與正常細(xì)胞相比多種腫瘤細(xì)胞中 USP18在大腦與中樞系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞以及乳腺癌腫瘤細(xì)胞中。相關(guān)（圖 3 紅色代表相對(duì)高表達(dá)，藍(lán)色代表相對(duì)低
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