發(fā)布時間：2020-11-18 14:27

　　 目的：探索Rafl的表達水平與非小細胞肺癌(NSCLC)臨床因素及預后的關系,體外水平明確miRNA-643靶向調控Raf1對NSCLC細胞侵襲、轉移及放射敏感性的影響。方法：免疫組化檢測NSCLC患者石蠟標本組織中Raf1的表達,分析Rafl表達與患者臨床病理特征、放療療效的相關性,風險比例模型(Cox回歸)分析影響NSCLC預后的危險因素；采用western blot和RT-PCR方法檢測不同NSCLC細胞株中Raf1的表達情況,選擇不同表達Rafl的A549和H1299細胞株,通過瞬時轉染獲得Raf1基因表達上調的A549和表達下調的H1299細胞株,運用CCK8、克隆實驗、劃痕實驗和Transwell小室檢測Raf1基因對NSCLC細胞增殖、侵襲、轉移及放射敏感性等生物學行為的影響。利用生物信息學在線軟件預測調控Raf1的上游miRNA, RT-PCR檢測miRNA-643在NSCLC細胞中的表達,雙熒光素酶報告系統驗證miRNA-643與Raf1的靶向調控關系；拯救實驗驗證miRNA-643調控靶基因Raf1表達在A549和H1299細胞侵襲、遷移能力和放射敏感性中的作用；同時檢測AKT/NF-κB通路及凋亡蛋白的表達變化。結果：1、110例接受根治性放射治療的NSCLC患者,Rafl蛋白表達49例(44.5%),其中高表達21例(19.1%)、低表達28例(25.5%),Raf1表達水平與腫瘤T分期、淋巴結轉移和細胞分化程度呈顯著相關(P0.05)；Raf1表達組患者的疾病進展時間和3年總生存期明顯差于Raf1不表達組(P0.05)。2、Raf1在H1299細胞中呈相對高表達, 而在A549及H827細胞中表達相對較低。沉默Raf1基因后,H1299細胞增殖、遷移及侵襲能力減弱,放射敏感性增加；而過表達Raf1基因后, A549細胞增殖、遷移及侵襲能力增加,放射抗拒增加。3、miRanda,TargetScan和TarBase在線預測miRNA-643可能與Raf1存在靶向關系,熒光素酶報告基因實驗證實miRNA-643靶向結合Raf1的3'-UTR區(qū)。過表達miRNA-643后,在mRNA和蛋白水平抑制Raf1的表達。4、進一步實驗顯示,利用Raf1表達載體轉染使穩(wěn)定表達miRNA-643的H1299細胞株中Raf1基因拯救性過表達,過表達Raf1可回復由于穩(wěn)定表達miRNA-643對細胞增殖、侵襲轉移及放射抗拒的抑制作用；而在穩(wěn)定干擾miRNA-643的A549細胞株中,干擾Raf1基因可減少由于miRNA-643低表達后細胞增殖、侵襲轉移及放射抗拒。5、Rafl過表達后,AKT及p65的表達及活性上調,EMT標記蛋白E-cadherin表達下調,而Vimentin蛋白上調；Raf1下調,AKT、p65、Vimentin及凋亡蛋白caspase-3和caspase-9下調,而E-cadherin及凋亡蛋白c-caspase-3和c-caspase-9表達上調。結論：Raf1與NSCLC放療后早期疾病進展及不良預后相關,增加NSCLC惡性進展及輻射抗拒；miRNA-643下調Raf1表達,在肺癌細胞增殖、侵襲轉移和放射敏感性方面發(fā)揮重要作用；高表達miRNA-643的肺癌細胞的生物學行為活性減弱,具有抑癌作用,增加肺癌細胞放射敏感性,為NSCLC的分子靶向治療及放射治療提供新的探索方向。
【學位單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：R734.2
【部分圖文】：

生存時間（Ｏｖｅｒａｌｌ?Ｓｕｒｖｉｖａｌ?０Ｓ）發(fā)現，民ａｆｌ表達患者的ＴＴＰ和０Ｓ要差于不表達??的患者；利用Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ分析Ｒａｆｌ對ＴＴＰ和３年ＯＳ影響，結果顯示Ｒａｆｌ??表達患者出現ＴＴＰ較不表達患者要早（圖２Ａ，Ｃ，Ｅ）?；?Ｒａｆｌ表達患者３年ＯＳ要??差于不表達的患者（圖２Ｂ，Ｄ，Ｆ），其中Ｒａｆｌ高表達患者與不表達沮間差異有統??計學意義（圖２Ｄ）。??Ｙ?１?Ｗ?Ｉ?醬＇??１：?�。�??？＊＂?＇?－?＇一１?＇?？？－?Ｉ?Ｉ?■?■?Ｉ?Ｉ?Ｉ??？？?？？?■■?ｍｍ?…?…?一??Ｍａｎｔａ?Ｍｏｎｆｆｎ??Ｄｆ＾ｌ?Ｉ?拍＂Ｅ］?－ｔｕ?｜馬￡?Ｆ??Ｉ…１…?ｈ?１…?扳??Ｉ?ＶＨ

Ｗｅｓｔｅｒｎ臥ｏｔ檢測民ａｆｌ在各肺癌細胞系中表達的本底水干。ｑＲＴ－ＰＣ民和Ｗｅｓｔｅｒｎ??Ｂｌｏｔ檢測結果均顯示，民ａｆｌ在高轉移細胞株Ｈ１２９９中表達最高，在Ａ５４９及Ｈ８２７??中低表達（圖３）。??？ｉ?Ｓ－Ｏ＂］?口?Ｈ８２７??＞?誦誦■??里？?？?Ｂ?Ａ５４９??Ｃ?２．５＇????名?■■?Ｈ１巧９??￡?２．０－??Ｉ?＾?５，?ｍｉｌ?Ａ５４９?Ｈ１２９９??￡?Ｔ－?Ｒｇｆ］側幽＾．?Ｍｆｉｉｂ??ｃ?＇ｎｎｇｉｌ??《０．０－Ｕ?—￣￣Ｉ￣￣￣￣ａｃｔｉｎ?ＰＷｒ???圖３：肺癌細胞株中Ｒａ打表達（ｍＲＮＡ水平和蛋白水平顯示高轉移Ｈ１２９９細??胞中Ｒａ打髙表達，轉移偏低Ａ５４９及Ｈ８２７細施中表達偏低）??２．

圖４：轉染后細胞株中Ｒａ打的表達情況??Ａ和Ｃ：?Ｒａ打在Ａ５４９細胞株中表達較對照沮増高??Ｂ和化Ｒａ打在Ｈ１２９９細胞株中表達較對照組降低??３？改變Ｒａｆｌ表達后肺癌細胞増殖能力明顯變化??在檢測Ｒａｆｌ基因對肺癌細胞株增殖活性的影響，我們利用轉染后的肺癌細胞??Ａ５４９和Ｈ１２９９，使用ＣＣＫ－８法檢測細胞增殖能力的改變，結果顯示隨著培養(yǎng)時??間的延長，上調民ａｆｌ表達的肺癌細胞株Ａ５４９増殖能力明顯增強（圖５Ａ），敲??低Ｒａｆｌ表達的肺癌細胞株Ｈ１２９９增殖能力明顯減弱（圖巧），兩組間差異有統??計學意義。??
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本文編號：2888820