目的：探索Rafl的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)臨床因素及預(yù)后的關(guān)系,體外水平明確miRNA-643靶向調(diào)控Raf1對(duì)NSCLC細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及放射敏感性的影響。方法：免疫組化檢測(cè)NSCLC患者石蠟標(biāo)本組織中Raf1的表達(dá),分析Rafl表達(dá)與患者臨床病理特征、放療療效的相關(guān)性,風(fēng)險(xiǎn)比例模型(Cox回歸)分析影響NSCLC預(yù)后的危險(xiǎn)因素；采用western blot和RT-PCR方法檢測(cè)不同NSCLC細(xì)胞株中Raf1的表達(dá)情況,選擇不同表達(dá)Rafl的A549和H1299細(xì)胞株,通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染獲得Raf1基因表達(dá)上調(diào)的A549和表達(dá)下調(diào)的H1299細(xì)胞株,運(yùn)用CCK8、克隆實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室檢測(cè)Raf1基因?qū)SCLC細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及放射敏感性等生物學(xué)行為的影響。利用生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測(cè)調(diào)控Raf1的上游miRNA, RT-PCR檢測(cè)miRNA-643在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá),雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miRNA-643與Raf1的靶向調(diào)控關(guān)系；拯救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miRNA-643調(diào)控靶基因Raf1表達(dá)在A549和H1299細(xì)胞侵襲、遷移能力和放射敏感性中的作用；同時(shí)檢測(cè)AKT/NF-κB通路及凋亡蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果：1、110例接受根治性放射治療的NSCLC患者,Rafl蛋白表達(dá)49例(44.5%),其中高表達(dá)21例(19.1%)、低表達(dá)28例(25.5%),Raf1表達(dá)水平與腫瘤T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和細(xì)胞分化程度呈顯著相關(guān)(P0.05)；Raf1表達(dá)組患者的疾病進(jìn)展時(shí)間和3年總生存期明顯差于Raf1不表達(dá)組(P0.05)。2、Raf1在H1299細(xì)胞中呈相對(duì)高表達(dá), 而在A549及H827細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)較低。沉默Raf1基因后,H1299細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力減弱,放射敏感性增加；而過(guò)表達(dá)Raf1基因后, A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力增加,放射抗拒增加。3、miRanda,TargetScan和TarBase在線預(yù)測(cè)miRNA-643可能與Raf1存在靶向關(guān)系,熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miRNA-643靶向結(jié)合Raf1的3'-UTR區(qū)。過(guò)表達(dá)miRNA-643后,在mRNA和蛋白水平抑制Raf1的表達(dá)。4、進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示,利用Raf1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染使穩(wěn)定表達(dá)miRNA-643的H1299細(xì)胞株中Raf1基因拯救性過(guò)表達(dá),過(guò)表達(dá)Raf1可回復(fù)由于穩(wěn)定表達(dá)miRNA-643對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及放射抗拒的抑制作用；而在穩(wěn)定干擾miRNA-643的A549細(xì)胞株中,干擾Raf1基因可減少由于miRNA-643低表達(dá)后細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及放射抗拒。5、Rafl過(guò)表達(dá)后,AKT及p65的表達(dá)及活性上調(diào),EMT標(biāo)記蛋白E-cadherin表達(dá)下調(diào),而Vimentin蛋白上調(diào)；Raf1下調(diào),AKT、p65、Vimentin及凋亡蛋白caspase-3和caspase-9下調(diào),而E-cadherin及凋亡蛋白c-caspase-3和c-caspase-9表達(dá)上調(diào)。結(jié)論：Raf1與NSCLC放療后早期疾病進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān),增加NSCLC惡性進(jìn)展及輻射抗拒；miRNA-643下調(diào)Raf1表達(dá),在肺癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和放射敏感性方面發(fā)揮重要作用；高表達(dá)miRNA-643的肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為活性減弱,具有抑癌作用,增加肺癌細(xì)胞放射敏感性,為NSCLC的分子靶向治療及放射治療提供新的探索方向。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R734.2
【部分圖文】：

生存時(shí)間（Ｏｖｅｒａｌｌ?Ｓｕｒｖｉｖａｌ?０Ｓ）發(fā)現(xiàn)，民ａｆｌ表達(dá)患者的ＴＴＰ和０Ｓ要差于不表達(dá)??的患者；利用Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ分析Ｒａｆｌ對(duì)ＴＴＰ和３年ＯＳ影響，結(jié)果顯示Ｒａｆｌ??表達(dá)患者出現(xiàn)ＴＴＰ較不表達(dá)患者要早（圖２Ａ，Ｃ，Ｅ）?；?Ｒａｆｌ表達(dá)患者３年ＯＳ要??差于不表達(dá)的患者（圖２Ｂ，Ｄ，Ｆ），其中Ｒａｆｌ高表達(dá)患者與不表達(dá)沮間差異有統(tǒng)??計(jì)學(xué)意義（圖２Ｄ）。??Ｙ?１?Ｗ?Ｉ?醬＇??１：?�。�??？＊＂?＇?－?＇一１?＇?？？－?Ｉ?Ｉ?■?■?Ｉ?Ｉ?Ｉ??？？?？？?■■?ｍｍ?…?…?一??Ｍａｎｔａ?Ｍｏｎｆｆｎ??Ｄｆ＾ｌ?Ｉ?拍＂Ｅ］?－ｔｕ?｜馬￡?Ｆ??Ｉ…１…?ｈ?１…?扳??Ｉ?ＶＨ

Ｗｅｓｔｅｒｎ臥ｏｔ檢測(cè)民ａｆｌ在各肺癌細(xì)胞系中表達(dá)的本底水干。ｑＲＴ－ＰＣ民和Ｗｅｓｔｅｒｎ??Ｂｌｏｔ檢測(cè)結(jié)果均顯示，民ａｆｌ在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Ｈ１２９９中表達(dá)最高，在Ａ５４９及Ｈ８２７??中低表達(dá)（圖３）。??？ｉ?Ｓ－Ｏ＂］?口?Ｈ８２７??＞?誦誦■??里？?？?Ｂ?Ａ５４９??Ｃ?２．５＇????名?■■?Ｈ１巧９??￡?２．０－??Ｉ?＾?５，?ｍｉｌ?Ａ５４９?Ｈ１２９９??￡?Ｔ－?Ｒｇｆ］側(cè)幽＾．?Ｍｆｉｉｂ??ｃ?＇ｎｎｇｉｌ??《０．０－Ｕ?—￣￣Ｉ￣￣￣￣ａｃｔｉｎ?ＰＷｒ???圖３：肺癌細(xì)胞株中Ｒａ打表達(dá)（ｍＲＮＡ水平和蛋白水平顯示高轉(zhuǎn)移Ｈ１２９９細(xì)??胞中Ｒａ打髙表達(dá)，轉(zhuǎn)移偏低Ａ５４９及Ｈ８２７細(xì)施中表達(dá)偏低）??２．

圖４：轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株中Ｒａ打的表達(dá)情況??Ａ和Ｃ：?Ｒａ打在Ａ５４９細(xì)胞株中表達(dá)較對(duì)照沮増高??Ｂ和化Ｒａ打在Ｈ１２９９細(xì)胞株中表達(dá)較對(duì)照組降低??３？改變Ｒａｆｌ表達(dá)后肺癌細(xì)胞増殖能力明顯變化??在檢測(cè)Ｒａｆｌ基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞株增殖活性的影響，我們利用轉(zhuǎn)染后的肺癌細(xì)胞??Ａ５４９和Ｈ１２９９，使用ＣＣＫ－８法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的改變，結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時(shí)??間的延長(zhǎng)，上調(diào)民ａｆｌ表達(dá)的肺癌細(xì)胞株Ａ５４９増殖能力明顯增強(qiáng)（圖５Ａ），敲??低Ｒａｆｌ表達(dá)的肺癌細(xì)胞株Ｈ１２９９增殖能力明顯減弱（圖巧），兩組間差異有統(tǒng)??計(jì)學(xué)意義。??
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本文編號(hào)：2888820