目的:通過實驗制備CD40單鏈抗體(CD40 single-chain antibody fragment,CD40ScFv),探討激動型CD40單鏈抗體的抗腫瘤作用與其在腫瘤微環(huán)境中上調(diào)PD-1的表達(dá),為激動性CD40單鏈抗體聯(lián)合抗PD-1單克隆抗體治療腫瘤提供實驗基礎(chǔ)和理論支持。方法:1、CD40ScFv蛋白的制備:根據(jù)本實驗室已獲得pCANTAB5E-CD40 ScFv噬菌粒,引入雙酶切位點,PCR擴(kuò)增目的基因CD40ScFv,利用定向克隆技術(shù)構(gòu)建pET28a-CD40ScFv重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Rosetta大腸桿菌,IPTG誘導(dǎo)CD40ScFv蛋白的表達(dá),純化蛋白并進(jìn)行蛋白復(fù)性和濃縮,BCA測定蛋白含量,SDS-PAGE和Western Blot鑒定所獲得的CD40ScFv蛋白。2、CD40ScFv的抗腫瘤作用:構(gòu)建負(fù)荷小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的Balb/C小鼠右腋下腫瘤模型,瘤體注射藥物進(jìn)行治療,根據(jù)治療藥物的不同,將荷瘤小鼠分成3組:CD40ScFv組、激動型CD40單克隆抗體組(CD40 monoclonal antibody,CD40mAb)和陰性對照生理鹽水(NS)組,觀察并記錄各組小鼠腫瘤體積的變化。3、CD40ScFv影響腫瘤微環(huán)境中PD-1分子表達(dá)的實驗研究:給予不同治療后,處死小鼠取瘤體組織,ELISA檢測腫瘤組織微環(huán)境中INF-γ的濃度,免疫組織化學(xué)染色檢測腫瘤組織中浸潤淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá)水平。結(jié)果:1、成功構(gòu)建pET28a-CD40ScFv重組質(zhì)粒,IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)的CD40ScFv蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定表達(dá)成功,分子大小為27KDa左右,經(jīng)純化后蛋白濃度為0.562 mg/mL。2、成功構(gòu)建小鼠乳腺癌模型,針對Balb/C小鼠的乳腺癌4T1細(xì)胞分別進(jìn)行不同治療后,CD40ScFv組腫瘤大小顯著小于NS組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而與激動型CD40mAb組無明顯區(qū)別(P0.05),表明CD40ScFv可以顯著抑制腫瘤的生長。3、CD40ScFv組腫瘤組織上清中INF-γ的濃度為(423.25±50.23)pg/mL,顯著高于NS組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而與激動型CD40mAb組相比無明顯差異(P0.05)。4、CD40ScFv組腫瘤微環(huán)境中PD-1表達(dá)陽性率為8.18%±2.01%,各組間存在顯著差異(F=10.624,P0.005)。CD40ScFv組PD-1的表達(dá)水平有著明顯上調(diào),相比于NS組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.005)。而與CD40 mAb組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、成功構(gòu)建攜帶CD40ScFv的pET28a-CD40ScFv重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Rosetta菌后經(jīng)誘導(dǎo)后可以穩(wěn)定表達(dá)有功能的CD40ScFv蛋白。2、CD40ScFv在體內(nèi)可以通過激活T淋巴細(xì)胞,促使其分泌一些細(xì)胞因子如IFN-γ等,發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。3、CD40ScFv能夠上調(diào)腫瘤微環(huán)境中浸潤淋巴細(xì)胞PD-1分子的表達(dá),為其與抗PD-1單克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用治療提供了前期實基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R730.51
【部分圖文】：

M：DNAMarker；1：目的基因 注: M：DNAMarker；1：pET28a-重組質(zhì)粒1 CD40ScFv 的凝膠電泳圖 圖 2 pET28a-CD40ScFv 原核的凝膠電泳圖D40ScFv 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化過測序結(jié)果，預(yù)期 CD40ScFv 目標(biāo)蛋白的大小約為 27kD。將鑒粒 pET28a-CD40ScFv 成功轉(zhuǎn)化入 Rosetta 大腸桿菌，在 IPTG 誘ol/L, 誘導(dǎo)溫度 37℃，誘導(dǎo)時間 3 小時的條件下誘導(dǎo) CD40ScFv 重組質(zhì)粒 pET28a-CD40ScFv 的 Rosetta 大腸桿菌成功表達(dá)大量 C用咪唑洗脫純化，如圖 3。

M：DNAMarker；1：目的基因 注: M：DNAMarker；1：pET28a-重組質(zhì)粒1 CD40ScFv 的凝膠電泳圖 圖 2 pET28a-CD40ScFv 原核的凝膠電泳圖D40ScFv 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化過測序結(jié)果，預(yù)期 CD40ScFv 目標(biāo)蛋白的大小約為 27kD。將鑒粒 pET28a-CD40ScFv 成功轉(zhuǎn)化入 Rosetta 大腸桿菌，在 IPTG 誘ol/L, 誘導(dǎo)溫度 37℃，誘導(dǎo)時間 3 小時的條件下誘導(dǎo) CD40ScFv 重組質(zhì)粒 pET28a-CD40ScFv 的 Rosetta 大腸桿菌成功表達(dá)大量 C用咪唑洗脫純化，如圖 3。

1：目的基因 注: M：DNAMark重凝膠電泳圖 圖 2 pET28a-C的凝誘導(dǎo)表達(dá)及純化期 CD40ScFv 目標(biāo)蛋白的大小約為0ScFv 成功轉(zhuǎn)化入 Rosetta 大腸桿菌37℃，誘導(dǎo)時間 3 小時的條件下誘8a-CD40ScFv 的 Rosetta 大腸桿菌成，如圖 3。
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本文編號：2887937