背景與目的:膀胱癌是導致世界癌癥相關性死亡的最常見泌尿系統(tǒng)腫瘤。手術,放療和化療是目前膀胱癌患者的主要治療方法,但生存率仍然不高。其中一個主要原因是膀胱癌進展的分子機制仍然不明確。Hippo信號通路和p38 MAPK通路是兩個非常重要的通路。Hippo信號通路的核心由多組分激酶級聯組成,其誘導磷酸化并抑制下游轉錄激活劑YAP和TAZ。YAP,TAZ或其他Hippo通路組分的放松管制將導致疾病的發(fā)生,包括許多癌癥。p38 MAPK通路是另一種控制細胞生長和死亡的高度保守的途徑。越來越多實驗證明了p38 MAPK通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移和化療反應中發(fā)揮了重要作用。在本研究中,我們構建了含有TAZ編碼區(qū)序列的sh RNA載體,以研究TAZ在膀胱癌細胞中的功能。此外,我們還探討了Hippo信號通路與p38 MAPK通路之間的功能的相互作用。方法與結果:首先,我們進行熒光定量PCR實驗確認了TAZ shRNA的干擾效率。其次,我們使用膀胱癌細胞系T24和5637進行細胞增殖實驗。CCK-8和EdU細胞增殖實驗表明,敲低TAZ的表達抑制了腫瘤細胞增殖。為了檢測細胞凋亡,我們通過western blot實驗證明了敲低TAZ的表達后,caspase3和cleaved-caspase3的蛋白水平增高,結果表明敲低TAZ誘導細胞凋亡。此外,western blot實驗也提示了TAZ可能調節(jié)p38蛋白的穩(wěn)定性。最后,為了研究p38的活性是否會影響TAZ對細胞增殖和凋亡的調控作用,我們使用p38抑制劑PH-797804阻斷了p38的活性。Western blot實驗結果顯示,當使用PH-797804處理后,抑制TAZ表達所導致的cleaved-caspase3的蛋白水平增加這一上調作用消失,cleaved-caspase3的蛋白水平與陰性對照組相比無明顯增加。而CCK-8和EdU細胞增殖實驗的結果顯示,通過PH-797804處理后,敲低TAZ導致的細胞增殖率降低這一結果被逆轉,腫瘤細胞的增殖數目增多,EdU陽性率升高。研究結果表明了p38的活性介導TAZ對細胞增殖和凋亡的調控作用。結論:TAZ在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起著致癌基因的作用,有可能成為膀胱癌的診斷標志物和治療靶標。TAZ shRNA可能為膀胱癌的體外基礎研究開辟了一條新的途徑。
【學位單位】：深圳大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737.14
【部分圖文】：

圖 1 驗證 TAZ 的敲低效率對照 shRNA 載體或 TAZ shRNA 載體轉染 T24 細胞，并進行實時熒光NA 水平。結果用平均數±標準差表示，N(樣本總數)=3,*** P<0.001。Z 的表達可以抑制膀胱癌細胞的增值為了研究 TAZ 是否調節(jié)膀胱癌細胞的生長，我們進行了細胞shRNA 載體或陰性對照 shRNA 載體的病毒轉染兩種膀胱癌細株。如圖 2-A 和 2-B 的 CCK-8 實驗所示，和對照組相比，s胞 T24(P<0.05)和 5637(P<0.05)的生長速率，可抑制細胞的增Z 的缺失會顯著抑制膀胱癌細胞的生長。減慢或細胞凋亡可能導致細胞生長減少。為了研究 TAZ shR們用 EdU 染色分析細胞增殖。如圖 2-C～H，與 shCtrl 對照組0.05)和 5637(P<0.05)細胞增值數目明顯減少，EdU 陽性率降低

TAZ 通過 p38 MAPK 通路調控膀胱癌細胞增殖和A）和 5637（B)的細胞增殖；(C-H)：EdU 測定 T來顯示細胞核。（E）和（H）分別計算了 T24 和差表示，N(樣本總數)=3,* P<0.05。Z 的表達可以誘導細胞的凋亡細胞凋亡，我們用 shCtrl 和 shTAZ 病毒載體相關凋亡蛋白的表達量。如圖 3 所示，敲低增加，同時 cleaved-caspase3（c-caspase3） 強烈地誘導細胞凋亡。

２８圖 4 TAZ 調節(jié) p38 蛋白的穩(wěn)定性：敲低 TAZ 的表達增加 p38 蛋白質水平和磷酸化水平。用攜帶 shCtrl 或 shTAZ 載4 細胞，然后用指定的抗體進行 western blot 分析；（B）：TAZ 的過表達下調 p38 蛋量的 Flag-TAZ 質粒轉染 T24 細胞，然后用指定的抗體進行 western blot 分析。（達不影響 p38 mRNA 的表達水平。用不同量的 Flag-TAZ 質粒轉染 T24 細胞，然 PCR 分析 TAZ（C）和 p38（D）mRNA 水平。p38 的活性介導 TAZ 對細胞增殖和凋亡的調控盡管 p38 MAPK 通路在細胞增殖和凋亡中起著關鍵作用，但迄今為止還沒AZ 的功能是由 p38 的活性介導的。為了驗證 TAZ 敲低的效果是否由 p3導的，我們敲低了 TAZ 的表達，再使用 p38 抑制劑 PH-797804 阻斷 p3
【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 Valentina Grossi;Alessia Peserico;Tugsan Tezil;Cristiano Simone;;p38α MAPK pathway:A key factor in colorectal cancer therapy and chemoresistance[J];World Journal of Gastroenterology;2014年29期

2 李洪生;吳湖炳;王巧愚;韓彥江;王全師;;~(18)F-FDGPET/CTF-FDGPET/CT雙時相顯像在膀胱癌術前分期中的臨床價值[J];南方醫(yī)科大學學報;2014年04期

本文編號：2887974