有研究報告顯示:我國癌癥新發(fā)人數(shù)繼續(xù)上升,結(jié)腸癌患者增長趨勢明顯。目前在臨床上治療結(jié)腸癌的主要措施是手術(shù)切除治療,輔以放射療法、化學(xué)藥物療法和免疫療法。手術(shù)治療之后,結(jié)直腸癌容易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),是結(jié)直腸癌引起患者死亡的主要原因。免疫治療是最有希望的腫瘤治療方式之一,曾入選《科學(xué)》雜志“2013十大科學(xué)突破”榜首�；诓《镜娜芰鲋委熝芯渴敲庖咧委煹闹匾緩街�,溶瘤病毒可以通過直接感染裂解腫瘤細(xì)胞、激活機(jī)體免疫系統(tǒng)等多種途徑發(fā)揮腫瘤的抑制或清除作用,部分溶瘤株已在臨床治療中顯示出良好的治療效果,其中一株改造過的HSV溶瘤病毒已經(jīng)在美國正式上市。NDV是一種禽類RNA主要感染禽類,偶見患者感染事件,引起結(jié)膜炎和溫和的流感癥狀等。從20世紀(jì)60年代開始,到如今已有73-T、MTH-68、PV701、HUJ、LaSota等多個NDV減毒株或弱毒株開展了一期和二期藥物臨床試驗,但都沒有進(jìn)入三期臨床試驗,提示現(xiàn)有的NDV弱毒株或減毒株的治療效果還不夠好,因此,有必要開發(fā)療效更好的NDV溶瘤病毒株。新城疫F48E9株是國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度株,關(guān)于F48E9用于溶瘤治療的研究幾乎沒有。胡立華等比較了 NDV強(qiáng)毒株F48E9和NDV弱毒株LaSota對大腸癌細(xì)胞LS1747的體外殺傷效果,提示F48E9可能具備溶瘤治療潛能,但是該研究沒有在動物水平上評估F48E9的溶瘤抑制效果和治療安全性。因此,本研究以結(jié)直腸癌為模型,研究NDV強(qiáng)毒株F48E9對腸癌細(xì)胞的體內(nèi)外抑制作用,并通過小鼠尾靜脈注射病毒評價F48E9體內(nèi)治療安全性。結(jié)果顯示MOI為0.1的F48E9對CT26細(xì)胞生長可表現(xiàn)出明顯的抑制作用,隨著MOI的升高,F48E9對細(xì)胞生長的抑制明顯加強(qiáng);0.1 mL濃度為2x107 pfu/mL的F48E9對BALB/c小鼠CT26皮下移植瘤的生長有顯著抑制作用,治療組的平均生存期為38.4天,未治療組的平均生存期為15.2天;免疫組化實驗顯示F48E9對CT26小鼠移植瘤細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用;F48E9尾靜脈注射正常BALB/c小鼠的安全性評估實驗顯示,該毒株對小鼠無明顯副作用。以上結(jié)果提示新城疫F48E9可以作為潛在的溶瘤候選株,用于進(jìn)一步的溶瘤治療研究。為了進(jìn)一步增強(qiáng)新城疫F48E9株的抗腫瘤活性,本研究嘗試構(gòu)建F48E9株反向遺傳系統(tǒng)用于對F48E9株進(jìn)行遺傳修飾。首先,對F48E9基因組進(jìn)行測序,構(gòu)建各個片段的亞基因組克隆至pblue載體,然后把各個片段構(gòu)建至同一個pCI-neo載體中,獲得F48E9株全長cDNA基因組克隆。同時,構(gòu)建F48E9株的三個輔助蛋白表達(dá)質(zhì)粒pCI-L、pCI-NP和pCI-P。然后四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于BHK21細(xì)胞中,并進(jìn)行血凝反應(yīng)和空斑實驗評估病毒重組效果。經(jīng)過鑒定,四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)的細(xì)胞裂解物有1個單位的血凝反應(yīng),但是不能夠形成空斑�？傊�,本研究評估了野生型新城疫F48E9株用于結(jié)直腸癌的治療效果,并進(jìn)行F48E9株對BALB/c小鼠的安全分析。發(fā)現(xiàn)F48E9能夠?qū)T26產(chǎn)生明顯的體外抑制效果和顯著的體內(nèi)溶瘤效果,同時對BALB/c沒有明顯的副作用。本研究還嘗試構(gòu)建F48E9株反向遺傳操作系統(tǒng),用于對F48E9株進(jìn)行基因組修飾。目前,我們已經(jīng)獲得了 F48E9株全長反義cDNA基因組克隆,以及三個輔助質(zhì)粒克隆。經(jīng)過鑒定,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒沒有得到具有感染活性rF48E9病毒粒子,還需進(jìn)一步的優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系。
【學(xué)位單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.3
【部分圖文】：

會存在一定的差異。為了獲得更加準(zhǔn)確的Ｆ４８Ｅ９毒株全基因組序列，為后續(xù)的反??向遺傳學(xué)操作提供依據(jù)，本研宄利用現(xiàn)有的Ｆ４８Ｅ９序列重新設(shè)計引物（表２－１?）。??按照圖示（圖２－丨）把Ｆ４８Ｅ９病毒全長基因組分為互相重疊的九段，為了比較準(zhǔn)??確地獲得病毒基因組３’－ＵＴＲ的序列，單獨(dú)設(shè)置了方向的反轉(zhuǎn)錄引物。引物設(shè)計??使用Ｏｌｉｇｏ６．０，引物由金唯智公司合成。??培養(yǎng)Ｆ４８Ｅ９病毒，連續(xù)空斑純化５個代次，取反復(fù)凍融的病毒液進(jìn)行ＲＮＡ??的提取和反轉(zhuǎn)錄獲得Ｆ４８Ｅ９株的ｃＤＮＡ基因組，使用高保真聚合酶進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)??增，每個擴(kuò)增反應(yīng)重復(fù)３次，釆用天根試劑盒進(jìn)行ＰＣＲ產(chǎn)物純化回收�；厥盏�??片段直接送閩博生物公司測序，使用Ｂｉｏ－Ｅｄｉｔ以及ＤＮＡｓｔａｒ等生物學(xué)軟件進(jìn)行??序列分析，獲得Ｆ４８Ｅ９基因組。??３＇－ＵＴＲ?Ｓ＇－ＵＴＲ??—＂．．．?＞■??２ＺＩ—ｒ￣￣＾??ＰＩ???－＊??ｒｆ〇?＊?Ｆ９??丄?Ｐ２??Ｆ〇?＊????Ｐ７??＾７—－

三果一部分新城疫Ｆ４８Ｅ９用于腸癌的治療研究??新城疫溶瘤株的培養(yǎng)和滴定??野生型的病毒株多為混合毒株，性質(zhì)不單一，本實驗在前期研宄中對獲得的??Ｅ９毒株進(jìn)行進(jìn)一步的空斑純化，并且經(jīng)過比對Ｆ４８Ｅ９株在不同的宿主細(xì)胞??制周期和病毒含量，確認(rèn)使用Ｖｅｒｏ細(xì)胞作為Ｆ４８Ｅ９毒株的生產(chǎn)細(xì)胞株。利??城疫Ｆ４８Ｅ９株ＮＰ蛋白單克隆抗體作為一抗進(jìn)行免疫熒光實驗，評價生產(chǎn)的??感染Ｖｅｒｏ細(xì)胞的活力（圖３－１．Ａ）。使用０．５％小鼠血球進(jìn)行血凝實驗，血??位可以達(dá)到１０格，進(jìn)行空斑形成實驗，發(fā)現(xiàn)Ｆ４８Ｅ９病毒可以產(chǎn)生明顯的空??（圖３－１．Ｂ）。經(jīng)過系列梯度稀釋之后進(jìn)行空斑滴定，獲得新城疫Ｆ４８Ｅ９株病毒??為２ｘｌ〇７ｐｆｕ／ｍＬ，分裝至病毒凍存管后儲存在－８０°Ｃ超低溫冰箱中。??Ａ?ＭＯＣＫ?ＮＤＶ－Ｆ４８Ｅ９??

＾?６０?Ｂ?ｔ?＇??ｉ?ｒ?１１１??ｉ??。。七々、ａ?＃?（ｍ〇＿＞??圖３－３．?ＮＤＶ－Ｆ４８Ｅ９對ＣＴ２６結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制作用??Ｆｉｇｕｒｅ?３－３．?Ｆ４８Ｅ９?ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ?ｔｈｅ?ｇｒｏｗｔｈ?ｏｆ?ＣＴ２６?ｃｏｌｏｎ?ｃａｎｃｅｒ?ｃｅｌｌｓ??３９??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2887730