研究背景:目前,隨著人類社會的變化,惡性腫瘤的發(fā)病率日趨增加,尤其是膽道系統(tǒng)中的膽囊癌,對人類身體健康構(gòu)成了非常大的威脅。隨著近現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,對膽囊癌癥疾病的發(fā)病有了全新的認(rèn)知,在早期診斷方面更及時化、規(guī)范化,為患者良好治療及預(yù)后提供了重要的指導(dǎo)意義。相關(guān)的研究結(jié)果顯示,在人類的調(diào)節(jié)基因中,miRNAs調(diào)節(jié)占比大約60%,其中主要的因子包括:原癌原因、腫瘤抑制因子等。上述比例,充分展示了 miRNAs和腫瘤之間的相關(guān)性。目前,微小RNA(miRNA)作為調(diào)節(jié)生物體中許多關(guān)鍵基因表達(dá)的基因研究越來越深入。miRNA是一種非編碼單鏈RNA,包含20-25個核苷酸,它們通過與靶向mRNA的3'-非編碼區(qū)結(jié)合,再轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在細(xì)胞中,RNA-poly II將miRNA轉(zhuǎn)錄成初級miRNA轉(zhuǎn)錄物,然后轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核中,由Drosha酶生成miRNA前體,其、后者在細(xì)胞質(zhì)中被加工成成熟的miRNA。miRNA可發(fā)揮多種生理功能,可以調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育,增殖和分化,細(xì)胞凋亡,參與各種免疫應(yīng)答,炎癥過程,也可參與一些自身免疫系統(tǒng)疾病和某些癌癥基因的表達(dá)。此外,在很多臨床標(biāo)本和癌癥組織中MiRNA能夠保持長期的穩(wěn)定性,所以miRNA可以用作某些癌癥預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。miR-155位于人類第21號染色體的非編碼轉(zhuǎn)錄區(qū)第3個外顯子內(nèi),由RNA聚合酶(RNA-polymerase)轉(zhuǎn)錄成前體 miRNA(pre-cursor miRNA,pre-miRNA),后者具有聚腺苷酸尾和帽結(jié)構(gòu)的短發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)。細(xì)胞核中,Drosha復(fù)合酶將其進(jìn)一步改造,使其轉(zhuǎn)化為60至70nt大小的核苷酸,然后在細(xì)胞質(zhì)中由DNA切割酶活化,最后產(chǎn)生約21-25nt大小的短miRNA。miRNA-155具有多種生物學(xué)功能,其主要功能主要體現(xiàn)在基因轉(zhuǎn)錄后和翻譯前調(diào)節(jié),進(jìn)而影響各種大分子物質(zhì)的表達(dá)。在一般情況下,成熟miRNA-155在T細(xì)胞和B細(xì)胞中表達(dá),其它參與表達(dá)的還有單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。后來,越來越多的研究證實miRNA-155的表達(dá)異常與許多疾病如癌癥,心血管疾病,炎癥,自身免疫疾病等相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),在乳腺癌、白血病、甲狀腺癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、膀胱癌和腎細(xì)胞癌等各類型的腫瘤中,miR-155均在此類惡性疾病的過度表達(dá)。以前,Kono等學(xué)者也提出了在膽囊癌中,miR-155有過度表達(dá)。在膽囊癌的發(fā)展過程中,miR-155體現(xiàn)出來的表達(dá)水平,與患者的淋巴轉(zhuǎn)移,以及預(yù)后情況,均顯示了二者之間明顯的相關(guān)性。另外,有相關(guān)的試驗證明,miR-155的異常表達(dá),也明顯增強(qiáng)了膽囊癌細(xì)胞的侵襲性。然而,miR-155在中國人群膽囊癌中的臨床意義還沒有研究過。目前,關(guān)于膽囊癌的發(fā)病機(jī)制卻未明確,治療的手段也比較單一,大多都是以手術(shù)切除的方式為主。但是,由于發(fā)病癥狀并不明顯,臨床癥狀也非常隱秘,因此,此類疾病的初期診斷率并不高。臨床上80%以上的患者在明確診斷時已屬中晚期,然而在大部分患者通過采取手術(shù)治療后,效果并不佳,甚至術(shù)后的復(fù)發(fā)率高達(dá)50%。由此可見,對于膽囊癌的化療手段顯得非常十分重要。本研究將在已有的研究基礎(chǔ)上,從細(xì)胞和機(jī)體兩個水平探究在膽囊癌患者中,miRNA-155的表達(dá)水平對索拉非尼化療效果的影響。目的:采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-PolymeRase Chain Reac-tion,RT-PCR)的方法,測定人膽囊癌組織及正常的膽囊組織中miR-155的表達(dá)。觀察miR-155有無異常表達(dá)及其在人膽囊癌診斷與治療中的臨床意義。(2)研究索拉非尼對人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞和膽囊癌患者的作用以及與miRNA-155表達(dá)的關(guān)系。方法:(1)選取我院2008年5月至2014年4月間行膽囊癌手術(shù)治療的病人,術(shù)前均未經(jīng)放療及化療,術(shù)后通過RT-PCR法測定膽囊癌組織和正常膽囊組織miR-155的表達(dá)。梅耶生存曲線(Kaplan-Meier)法,分析患者術(shù)后5年生存率。(2)索拉非尼處理GBC-SD細(xì)胞:分為正常細(xì)胞對照組、GBC-SD細(xì)胞組和不同劑量索拉非尼處理組(劑量分別為3、6和12 μmol/l)。采用RT-PCR法測定相應(yīng)細(xì)胞中miR-155的表達(dá)水平;采用四氮唑鹽還原(MTT)法檢測細(xì)胞活性;采用流式細(xì)胞儀檢測GBC-SD細(xì)胞的凋亡情況。(3)選取本院收治的26例接受索拉非尼化療的膽囊癌患者,術(shù)后取癌組織及癌旁組織檢測miR-155表達(dá),分析miR-155的表達(dá)水平變化及其與患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果:(1)miR-155在膽囊癌組織和正常膽囊組織中的表達(dá):133例膽囊癌組織中miR-155的表達(dá)水平,均明顯高于正常膽囊組織,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。miR-155表達(dá)水平與臨床病理特征:miR-155高表達(dá)與TNM分期(P = 0.003),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P = 0.042),肝臟轉(zhuǎn)移(P = 0.010),以及分化程度(P0.001)等密切相關(guān)。miR-155表達(dá)和其他臨床病理因素,包括性別,年齡(所有P0.05,表1示)之間沒有顯著關(guān)聯(lián)。miR-155表達(dá)與患者的生存相關(guān)性:與miR-155低表達(dá)的患者比,miR-155高表達(dá)的膽囊癌患者,其總體生存期明顯更長,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P= 0.03)。另外膽囊癌患者術(shù)后總生存期的影響因素很多,多因素分析發(fā)現(xiàn),miR-155表達(dá)水平高低可以作為其獨立預(yù)后因素之一。(HR=2.394,95%CI:1.568-10.034;P = 0.009)。(2)索拉非尼對人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞活性的影響:MTT檢測結(jié)果顯示,不同濃度(3、6和12μmol/l))索拉非尼處理GBC-SD細(xì)胞不同時間(24、48和72h)后,GBC-SD細(xì)胞活性均受到不同程度的抑制,其抑制作用隨作用濃度和時間的增加而增強(qiáng),其中以12 μmol/L作用72h時,抑制率為79.96±7.53%,抑制作用最強(qiáng)。(3)索拉非尼對人膽囊癌細(xì)胞凋亡的影響:流式細(xì)胞儀分析索拉非尼對GBC-SD細(xì)胞凋亡的影響,在不同劑量的索拉非尼處理下,GBC-SD細(xì)胞的凋亡率變化明顯,在3、6和12 μmol/1的索拉非尼處理組中,GBC-SD細(xì)胞的凋亡率依次是17.46±2.1%、28.64±4.9%和57.47±8.03%,與對照組相比,各個劑量索拉非尼處理組GBC-SD細(xì)胞的凋亡率差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05或PO.01),而且表達(dá)出與劑量的相關(guān)性。(4)索拉非尼對人膽囊癌細(xì)胞GBC-SD miR-155表達(dá)的影響:在正常膽囊細(xì)胞中miR-155表達(dá)較低,而在GBC-SD細(xì)胞中miR155的表達(dá)顯著上調(diào)(P0.01);與正常對照組相比,GBC-SD細(xì)胞經(jīng)索拉非尼處理后,miR-155的表達(dá)又顯著下降(P0.01),且表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。尤其是在12μmol/L的索拉非尼處理下,miR-155的表達(dá)水平和正常對照組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(5)索拉非尼對人膽囊癌患者miR-155表達(dá)的影響:在膽囊癌組織中,miR-155表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織(P0.01)。當(dāng)患者接受索拉非尼化療后,患者膽囊癌組織中miR-155表達(dá)顯著下降,與膽囊癌組比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義、(P0.01)。(6)索拉非尼對人膽囊癌患者預(yù)后的影響:隨訪發(fā)現(xiàn),患者術(shù)后生存時間與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度以及miR-155表達(dá)水平有關(guān)。Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ期膽囊癌患者經(jīng)索拉非尼化療后,平均生存時間分別為46.4±8.9和18.5±2.4月,兩組患者生存時間之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度高、低的患者生存時間也具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。尤其在miR-155高表達(dá)和低表達(dá)的患者中,索拉非尼化療后生存時間分別是19.4±3.9月和37.6±4.0月,兩者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:(1)miR-155在膽囊癌組織中表達(dá)水平顯著高于正常膽囊組織,其高表達(dá)與TNM分期、分化程度及肝臟轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān),且miR-155高表達(dá)的膽囊癌患者總體生存期明顯低于miR-155低表達(dá)的患者,提示miR-155高表達(dá)可作為中國人群中膽囊癌患者預(yù)后不良的一個指標(biāo)。(2)不同濃度索拉非尼處理GBC-SD細(xì)胞后GBC-SD細(xì)胞活性均受到不同程度的抑制,細(xì)胞的凋亡率明顯上升。使用索拉非尼化療的膽囊癌患者平均生存時間延長,提示使用索拉非尼化療后GBC-SD細(xì)胞miR-155表達(dá)水平的下降與其化療效果和患者的預(yù)后生存密切相關(guān)。(3)索拉非尼可能通過下調(diào)miR-155表達(dá)抑制GBC-SD細(xì)胞的活性、促進(jìn)GBC-SD細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.8
【部分圖文】：

ｎｕｍｂｅｒ?Ｈｉｇｈ（ｎ＝６８）?６１?２９７２?３９７９?３６?５４?３２ｅ??９２?３９４１?２９ｄｅ?ｓｔａｔｕｓ??２４?１７１０９?５１ａｓｔａｓｉｓ??２２?１７１１１?５１ａｔｅｄ?ｄｅｇｒｅｅ??８８?３５ｔｅ／ｐｏｏｒ?４５?３３５高表達(dá)與ＴＮＭ分麵（Ｐ?＝?０．Ｑ０３），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（Ｐ?＝?度（Ｐ?＜〇．〇〇１）等密切相關(guān)。ｍｉＲ－１５５表達(dá)和其他?０５）之間沒有顯著關(guān)聯(lián)。??５

２?Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線顯示ｍｉＲ－１５５水平和膽囊癌患者的：通過ＫａｐｌａｎＭｅｉｅｒ法和對數(shù)秩檢驗法來分析低表達(dá)組和高ｉＲ－１５５高表達(dá)的膽囊癌患者總體生存期明顯低于ｍｉＲ－１５５低２多因素分析預(yù)測膽囊癌術(shù)后總生存期??Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ?ＨＲ?９５％?Ｃｌ?Ｐ?ｖＡｇｅ?１．３５２?０．４４９－２．０３８?０．Ｇｅｎｄｅｒ?０．４５８?０．２３９－３．１０２?０．ＴＮＭ?ｓｔａｇｅ?２．３９１?１．２８３－９．９９５?０．Ｌｙｍｐｈ?ｎｏｄｅ?ｓｔａｔｕｓ?２．３８３?１．２０１－７．９２５?０．Ｌｉｖｅｒ?ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ?１．２９１?１．００１－６．１９２?０．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ?ｄｅｇｒｅｅ?２．１０２?０．９９３－７．９２７?０．ｍｉＲ－１５５?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?２．３９４?１．５６８－１０．０３４?０．：多因素分析發(fā)現(xiàn)ｒａｉＲ－１５５表達(dá)水平是膽囊癌患者術(shù)后總生５?％ＣＩ：?１．５６８－１０．?０３４；?Ｐ－３?〇．〇〇９）。??表３相應(yīng)基因的引物列表基因?序列??

１２??Ｓｏｒａｆｃｎｉｂ?（ｊｉＭｏｌ／Ｄ??圖３Ｂ索拉非尼對ＧＢＣ－ＳＤ細(xì)胞凋亡的影響，與對照組相比，每個劑量索拉非尼處理下ＧＢＣ－ＳＤ??２８??
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 石景森;鄭見寶;;進(jìn)一步提高膽囊癌診治的總體水平[J];臨床肝膽病雜志;2013年06期

本文編號：2887694