研究背景與目的:多發(fā)性骨髓瘤是克隆性漿細(xì)胞在骨髓中無(wú)限制性增殖的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。蛋白酶體抑制劑在骨髓瘤的耐藥機(jī)制尚不清楚。外泌體是直徑約為40-150 nm的小囊泡體。作為細(xì)胞間相互作用的重要方式,外泌體可通過(guò)膜受體或內(nèi)吞的方式進(jìn)入靶細(xì)胞,傳遞其攜帶的m RNA、非編碼RNA、蛋白質(zhì)等;或者通過(guò)其表面信號(hào)分子與靶細(xì)胞表面受體結(jié)合,產(chǎn)生信號(hào)復(fù)合體,激活相關(guān)分子信號(hào)通路等改變受體細(xì)胞的行為。長(zhǎng)鏈非編碼RNA是轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt且沒(méi)有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子,具有重要的生物學(xué)及病理學(xué)功能。長(zhǎng)鏈非編碼RNA和腫瘤微環(huán)境來(lái)源的外泌體在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及耐藥中發(fā)揮重要作用。多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓微環(huán)境中的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)至關(guān)重要。本研究目的在于探究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體在骨髓瘤蛋白酶體抑制劑耐藥中的作用,并闡明其可能的分子機(jī)制。研究方法:1.分離鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體。PEG法分離外泌體;Western blot鑒定外泌體標(biāo)記蛋白;納米顆粒分析儀分析外泌體粒徑大小;透射電鏡檢測(cè)其形態(tài)和大小。2.采用綠色熒光染料PKH67對(duì)外泌體進(jìn)行熒光染色標(biāo)記,將標(biāo)記的外泌體與骨髓瘤細(xì)胞共孵育。流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦下示蹤觀察,檢測(cè)骨髓瘤細(xì)胞對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體的攝取。3.將硼替佐米耐藥和敏感患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體分別與骨髓瘤細(xì)胞共孵育,CCK8檢測(cè)其對(duì)骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響。4.利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù),分析篩選骨髓瘤硼替佐米耐藥和敏感患者CD138+細(xì)胞中差異表達(dá)的lnc RNA和m RNA。利用臨床樣本及蛋白酶體抑制劑耐藥細(xì)胞株驗(yàn)證分析結(jié)果。5.利用RNAi在硼替佐米耐藥患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中下調(diào)PSMA3-AS1和PSMA3的表達(dá),同時(shí)在硼替佐米敏感患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中上調(diào)PSMA3-AS1和PSMA3的表達(dá)。分別分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體,與骨髓瘤細(xì)胞共孵育,CCK8檢測(cè)其對(duì)骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響。6.利用RNAi在骨髓瘤細(xì)胞中下調(diào)PSMA3-AS1和PSMA3的表達(dá),熒光底物測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞的蛋白酶體胰凝乳樣蛋白酶活性,CCK8檢測(cè)骨髓瘤細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑敏感性。骨髓瘤細(xì)胞中下調(diào)PSMA3-AS1的同時(shí)過(guò)表達(dá)PSMA3,熒光底物測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞的蛋白酶體胰凝乳樣蛋白酶活性,CCK8檢測(cè)骨髓瘤細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑敏感性。7.Lnc RNA PSMA3-AS1的特性鑒定:Northern blot檢測(cè)PSMA3-AS1在骨髓瘤細(xì)胞中的表達(dá);5’RACE和3’RACE技術(shù)克隆PSMA3-AS1轉(zhuǎn)錄本的全長(zhǎng);生物信息學(xué)(ORF-finder,CPC和CPAT)分析其非編碼特性;通過(guò)核質(zhì)分離和RNA-FISH確定PSMA3-AS1在骨髓瘤細(xì)胞中的定位。8.利用核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)和α-鵝膏蕈堿實(shí)驗(yàn)研究PSMA3-AS1對(duì)PSMA3穩(wěn)定性的影響。9.利用小鼠骨髓瘤原位模型,在體內(nèi)水平研究特異性靶向PSMA3-AS1的si RNA對(duì)骨髓瘤蛋白酶體抑制劑藥物敏感性的作用。10.分別提取硼替佐米耐藥和敏感骨髓瘤患者外周血來(lái)源的循環(huán)外泌體,q RT-PCR檢測(cè)PSMA3-AS1和PSMA3的表達(dá)量,單因素分析和多因素分析判斷循環(huán)外泌體中PSMA3-AS1和PSMA3的表達(dá)量與骨髓瘤患者預(yù)后的關(guān)系。研究結(jié)果:1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以被骨髓瘤細(xì)胞攝取,骨髓瘤細(xì)胞對(duì)硼替佐米耐藥和敏感患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體的攝取效率相同。2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)外泌體傳遞耐藥性,來(lái)源于硼替佐米耐藥的多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體可以降低骨髓瘤細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑的敏感性。3.利用GEO數(shù)據(jù)(GSE9782),通過(guò)基因富集和基因差異篩選分析,結(jié)果表明硼替佐米耐藥患者骨髓瘤CD138+細(xì)胞中PSMA3和PSMA3-AS1的表達(dá)明顯高于硼替佐米敏感患者骨髓瘤CD138+細(xì)胞中的表達(dá)。并且,應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析,結(jié)果表明PSMA3高表達(dá)與患者的總體生存期和無(wú)進(jìn)展生存期具有相關(guān)性。在12例硼替佐米耐藥和45例硼替佐米敏感骨髓瘤患者的臨床樣本中,與硼替佐米敏感患者相比,PSMA3和PSMA3-AS1在硼替佐米耐藥患者的骨髓瘤CD138+細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中均高表達(dá)。蛋白酶體抑制劑耐藥細(xì)胞株中PSMA3和PSMA3-AS1的表達(dá)明顯高于其親本細(xì)胞。4.來(lái)源于PSMA3-AS1和PSMA3下調(diào)的硼替佐米耐藥骨髓瘤患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體可以增強(qiáng)骨髓瘤細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑的敏感性,來(lái)源于PSMA3-AS1和PSMA3上調(diào)的硼替佐米敏感骨髓瘤患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體可以降低骨髓瘤細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑的敏感性。5.骨髓瘤細(xì)胞中下調(diào)PSMA3-AS1和PSMA3使得骨髓瘤細(xì)胞的蛋白酶體活性下降,骨髓瘤細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑的敏感性增強(qiáng);過(guò)表達(dá)PSMA3可恢復(fù)骨髓瘤細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑的耐藥。6.PSMA3-AS1在骨髓瘤細(xì)胞表達(dá);PSMA3-AS1存在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本且不具有蛋白編碼能力;核質(zhì)分離和RNA-FISH結(jié)果表明PSMA3-AS1在骨髓瘤細(xì)胞胞漿和胞核中都表達(dá)。7.PSMA3-AS1通過(guò)增強(qiáng)PSMA3前體m RNA的穩(wěn)定性增加PSMA3表達(dá),后者使蛋白酶體活性增加,進(jìn)而減低骨髓瘤細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑的敏感性。8.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,特異性靶向PSMA3-AS1的si RNA可以增加骨髓瘤對(duì)蛋白酶體抑制劑敏感性。9.與硼替佐米敏感患者相比,PSMA3-AS1和PSMA3在硼替佐米耐藥骨髓瘤患者外周血的循環(huán)外泌體中高表達(dá)。單因素分析和多因素分析結(jié)果表明,循環(huán)外泌體中PSMA3-AS1和PSMA3高表達(dá)與患者的總體生存期和無(wú)進(jìn)展生存期密切相關(guān)。結(jié)論:本研究通過(guò)GEO數(shù)據(jù)分析和臨床樣本驗(yàn)證篩選出在骨髓瘤蛋白酶體抑制劑耐藥細(xì)胞中高表達(dá)且有功能的lnc RNA,即lnc PSMA3-AS1。PSMA3-AS1和PSMA3可通過(guò)外泌體從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳遞至骨髓瘤細(xì)胞,使骨髓瘤細(xì)胞中PSMA3-AS1和PSMA3的表達(dá)增高,蛋白酶體活性增強(qiáng),細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑的敏感性降低。同時(shí)PSMA3高表達(dá)預(yù)示著骨髓瘤患者對(duì)硼替佐米的反應(yīng)性較差,患者的總體生存期和無(wú)進(jìn)展生存期較短。分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),PSMA3-AS1是從蛋白酶體亞基PSMA3反義鏈轉(zhuǎn)錄出來(lái)的非編碼RNA,通過(guò)與PSMA3前體m RNA結(jié)合形成RNA雙鏈增強(qiáng)PSMA3的穩(wěn)定性,增加PSMA3的表達(dá),進(jìn)而減低骨髓瘤細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑的敏感性。體內(nèi)研究證明,在體內(nèi)水平靶向PSMA3-AS1能夠增加骨髓瘤對(duì)蛋白酶體抑制劑的敏感性,延長(zhǎng)整體存活時(shí)間。同時(shí),骨髓瘤患者外周血來(lái)源的循環(huán)外泌體中PSMA3-AS1和PSMA3的表達(dá)量與骨髓瘤患者的預(yù)后具有相關(guān)性。綜上所述,PSMA3-AS1不僅可以作為預(yù)測(cè)蛋白酶體抑制劑治療反應(yīng)性的標(biāo)志物,而且可以作為骨髓瘤蛋白酶體抑制劑耐藥的治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R733.3
【部分圖文】：

MSCs分泌的exosomes在透射電鏡下的形態(tài)

MSCs分泌的exosomes的直徑分布情況

Westernblot檢測(cè)MSCs分泌的exosomes的表面標(biāo)記物以上結(jié)果提示，PEG法可以成功分離MSCs分泌的exosomes
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本文編號(hào)：2887625