研究背景與目的:多發(fā)性骨髓瘤是克隆性漿細胞在骨髓中無限制性增殖的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。蛋白酶體抑制劑在骨髓瘤的耐藥機制尚不清楚。外泌體是直徑約為40-150 nm的小囊泡體。作為細胞間相互作用的重要方式,外泌體可通過膜受體或內(nèi)吞的方式進入靶細胞,傳遞其攜帶的m RNA、非編碼RNA、蛋白質(zhì)等;或者通過其表面信號分子與靶細胞表面受體結(jié)合,產(chǎn)生信號復合體,激活相關(guān)分子信號通路等改變受體細胞的行為。長鏈非編碼RNA是轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt且沒有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子,具有重要的生物學及病理學功能。長鏈非編碼RNA和腫瘤微環(huán)境來源的外泌體在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及耐藥中發(fā)揮重要作用。多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓微環(huán)境中的間充質(zhì)干細胞對骨髓瘤細胞的生長至關(guān)重要。本研究目的在于探究骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體在骨髓瘤蛋白酶體抑制劑耐藥中的作用,并闡明其可能的分子機制。研究方法:1.分離鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體。PEG法分離外泌體;Western blot鑒定外泌體標記蛋白;納米顆粒分析儀分析外泌體粒徑大小;透射電鏡檢測其形態(tài)和大小。2.采用綠色熒光染料PKH67對外泌體進行熒光染色標記,將標記的外泌體與骨髓瘤細胞共孵育。流式細胞術(shù)和激光共聚焦下示蹤觀察,檢測骨髓瘤細胞對間充質(zhì)干細胞來源外泌體的攝取。3.將硼替佐米耐藥和敏感患者骨髓間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體分別與骨髓瘤細胞共孵育,CCK8檢測其對骨髓瘤細胞生長活力的影響。4.利用GEO數(shù)據(jù)庫,分析篩選骨髓瘤硼替佐米耐藥和敏感患者CD138+細胞中差異表達的lnc RNA和m RNA。利用臨床樣本及蛋白酶體抑制劑耐藥細胞株驗證分析結(jié)果。5.利用RNAi在硼替佐米耐藥患者骨髓間充質(zhì)干細胞中下調(diào)PSMA3-AS1和PSMA3的表達,同時在硼替佐米敏感患者骨髓間充質(zhì)干細胞中上調(diào)PSMA3-AS1和PSMA3的表達。分別分離骨髓間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體,與骨髓瘤細胞共孵育,CCK8檢測其對骨髓瘤細胞生長活力的影響。6.利用RNAi在骨髓瘤細胞中下調(diào)PSMA3-AS1和PSMA3的表達,熒光底物測定法檢測細胞的蛋白酶體胰凝乳樣蛋白酶活性,CCK8檢測骨髓瘤細胞對蛋白酶體抑制劑敏感性。骨髓瘤細胞中下調(diào)PSMA3-AS1的同時過表達PSMA3,熒光底物測定法檢測細胞的蛋白酶體胰凝乳樣蛋白酶活性,CCK8檢測骨髓瘤細胞對蛋白酶體抑制劑敏感性。7.Lnc RNA PSMA3-AS1的特性鑒定:Northern blot檢測PSMA3-AS1在骨髓瘤細胞中的表達;5’RACE和3’RACE技術(shù)克隆PSMA3-AS1轉(zhuǎn)錄本的全長;生物信息學(ORF-finder,CPC和CPAT)分析其非編碼特性;通過核質(zhì)分離和RNA-FISH確定PSMA3-AS1在骨髓瘤細胞中的定位。8.利用核酸酶保護實驗和α-鵝膏蕈堿實驗研究PSMA3-AS1對PSMA3穩(wěn)定性的影響。9.利用小鼠骨髓瘤原位模型,在體內(nèi)水平研究特異性靶向PSMA3-AS1的si RNA對骨髓瘤蛋白酶體抑制劑藥物敏感性的作用。10.分別提取硼替佐米耐藥和敏感骨髓瘤患者外周血來源的循環(huán)外泌體,q RT-PCR檢測PSMA3-AS1和PSMA3的表達量,單因素分析和多因素分析判斷循環(huán)外泌體中PSMA3-AS1和PSMA3的表達量與骨髓瘤患者預后的關(guān)系。研究結(jié)果:1.骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可以被骨髓瘤細胞攝取,骨髓瘤細胞對硼替佐米耐藥和敏感患者骨髓間充質(zhì)干細胞來源外泌體的攝取效率相同。2.骨髓間充質(zhì)干細胞通過外泌體傳遞耐藥性,來源于硼替佐米耐藥的多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓間充質(zhì)干細胞的外泌體可以降低骨髓瘤細胞對蛋白酶體抑制劑的敏感性。3.利用GEO數(shù)據(jù)(GSE9782),通過基因富集和基因差異篩選分析,結(jié)果表明硼替佐米耐藥患者骨髓瘤CD138+細胞中PSMA3和PSMA3-AS1的表達明顯高于硼替佐米敏感患者骨髓瘤CD138+細胞中的表達。并且,應(yīng)用Log-rank檢驗進行單因素分析,結(jié)果表明PSMA3高表達與患者的總體生存期和無進展生存期具有相關(guān)性。在12例硼替佐米耐藥和45例硼替佐米敏感骨髓瘤患者的臨床樣本中,與硼替佐米敏感患者相比,PSMA3和PSMA3-AS1在硼替佐米耐藥患者的骨髓瘤CD138+細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞中均高表達。蛋白酶體抑制劑耐藥細胞株中PSMA3和PSMA3-AS1的表達明顯高于其親本細胞。4.來源于PSMA3-AS1和PSMA3下調(diào)的硼替佐米耐藥骨髓瘤患者骨髓間充質(zhì)干細胞的外泌體可以增強骨髓瘤細胞對蛋白酶體抑制劑的敏感性,來源于PSMA3-AS1和PSMA3上調(diào)的硼替佐米敏感骨髓瘤患者骨髓間充質(zhì)干細胞的外泌體可以降低骨髓瘤細胞對蛋白酶體抑制劑的敏感性。5.骨髓瘤細胞中下調(diào)PSMA3-AS1和PSMA3使得骨髓瘤細胞的蛋白酶體活性下降,骨髓瘤細胞對蛋白酶體抑制劑的敏感性增強;過表達PSMA3可恢復骨髓瘤細胞對蛋白酶體抑制劑的耐藥。6.PSMA3-AS1在骨髓瘤細胞表達;PSMA3-AS1存在兩個轉(zhuǎn)錄本且不具有蛋白編碼能力;核質(zhì)分離和RNA-FISH結(jié)果表明PSMA3-AS1在骨髓瘤細胞胞漿和胞核中都表達。7.PSMA3-AS1通過增強PSMA3前體m RNA的穩(wěn)定性增加PSMA3表達,后者使蛋白酶體活性增加,進而減低骨髓瘤細胞對蛋白酶體抑制劑的敏感性。8.體內(nèi)實驗結(jié)果表明,特異性靶向PSMA3-AS1的si RNA可以增加骨髓瘤對蛋白酶體抑制劑敏感性。9.與硼替佐米敏感患者相比,PSMA3-AS1和PSMA3在硼替佐米耐藥骨髓瘤患者外周血的循環(huán)外泌體中高表達。單因素分析和多因素分析結(jié)果表明,循環(huán)外泌體中PSMA3-AS1和PSMA3高表達與患者的總體生存期和無進展生存期密切相關(guān)。結(jié)論:本研究通過GEO數(shù)據(jù)分析和臨床樣本驗證篩選出在骨髓瘤蛋白酶體抑制劑耐藥細胞中高表達且有功能的lnc RNA,即lnc PSMA3-AS1。PSMA3-AS1和PSMA3可通過外泌體從骨髓間充質(zhì)干細胞傳遞至骨髓瘤細胞,使骨髓瘤細胞中PSMA3-AS1和PSMA3的表達增高,蛋白酶體活性增強,細胞對蛋白酶體抑制劑的敏感性降低。同時PSMA3高表達預示著骨髓瘤患者對硼替佐米的反應(yīng)性較差,患者的總體生存期和無進展生存期較短。分子機制研究發(fā)現(xiàn),PSMA3-AS1是從蛋白酶體亞基PSMA3反義鏈轉(zhuǎn)錄出來的非編碼RNA,通過與PSMA3前體m RNA結(jié)合形成RNA雙鏈增強PSMA3的穩(wěn)定性,增加PSMA3的表達,進而減低骨髓瘤細胞對蛋白酶體抑制劑的敏感性。體內(nèi)研究證明,在體內(nèi)水平靶向PSMA3-AS1能夠增加骨髓瘤對蛋白酶體抑制劑的敏感性,延長整體存活時間。同時,骨髓瘤患者外周血來源的循環(huán)外泌體中PSMA3-AS1和PSMA3的表達量與骨髓瘤患者的預后具有相關(guān)性。綜上所述,PSMA3-AS1不僅可以作為預測蛋白酶體抑制劑治療反應(yīng)性的標志物,而且可以作為骨髓瘤蛋白酶體抑制劑耐藥的治療靶點。
【學位單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R733.3
【部分圖文】：

MSCs分泌的exosomes在透射電鏡下的形態(tài)

MSCs分泌的exosomes的直徑分布情況

Westernblot檢測MSCs分泌的exosomes的表面標記物以上結(jié)果提示，PEG法可以成功分離MSCs分泌的exosomes
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本文編號：2887625