[目的]腫瘤演進(jìn)過程中,腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞的相互作用備受關(guān)注。與正常成纖維細(xì)胞相比,腫瘤基質(zhì)中的成纖維細(xì)胞即癌相關(guān)成纖維細(xì)胞處于活化狀態(tài),但其活化機(jī)制尚不明了。本研究通過建立口腔癌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)模型,探索血小板源性生長(zhǎng)因子BB及其受體(PDGF-BB/PDGFR-β)介導(dǎo)癌細(xì)胞誘導(dǎo)成纖維活化的作用及相關(guān)機(jī)制,從基質(zhì)角度闡明腫瘤演進(jìn)機(jī)理并詮釋癌細(xì)胞與基質(zhì)成纖維細(xì)胞的內(nèi)在關(guān)系及其分子事件,為探索通過干預(yù)PDGF-BB/PDGFR-β通路防治腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。[方法](1)細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)正常人口腔黏膜角質(zhì)化細(xì)胞hOMK(Normal human Oral Mucosa(P2)500K Keratinocytes cells,新加坡 Cell Research Corp)、人口腔舌鱗癌細(xì)胞Cal-27(美國(guó)ATCC)、正常人口腔黏膜成纖維細(xì)胞hOMF(Normal human Oral Mucosa(P3)500K fibroblast cells,新加坡 CellResearch Corp)。(2)上皮細(xì)胞差異分泌因子篩選用RayBio QAH-CAA-1000芯片雜交技術(shù)檢測(cè)hOMK及Cal-27細(xì)胞分泌因子,篩選差異分泌因子,并用ELISA驗(yàn)證。(3)條件培養(yǎng)基的制備hOMK及Cal-27細(xì)胞分別接種至150ml培養(yǎng)瓶,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合達(dá)約80%時(shí),更換新的完全培養(yǎng)基持續(xù)孵育24h,收集細(xì)胞上清液,4℃、15000g離心30min去除細(xì)胞碎片,0.22μm直徑微孔濾膜除菌,-20℃保存以備用。(4)成纖維細(xì)胞活化誘導(dǎo)用含有30ng/ml PDGF-BB因子的完全培養(yǎng)基或1/3體積Cal-27細(xì)胞上清和2/3體積的完全培養(yǎng)基對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),每3天傳代處理一次,傳代處理3次后,對(duì)各組成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行分析,獲得活化的成纖維細(xì)胞(AF)。(5)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),透射電鏡觀察微管及致密斑等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。(6)免疫熒光染色檢測(cè)成纖維細(xì)胞PDGFR-β的表達(dá)。(7)成纖維細(xì)胞趨化因子分泌檢測(cè)趨化因子芯片檢測(cè)正常成纖維細(xì)胞和活化成纖維細(xì)胞分泌的趨化因子,篩選差異分泌的趨化因子,行ELISA和qPCR驗(yàn)證。(8)成纖維細(xì)胞miRNAs表達(dá)檢測(cè)Human Cancer Focus microRNATarget mRNA PCR Array 芯片檢測(cè)正常成纖維細(xì)胞和活化成纖維細(xì)胞miRNAs表達(dá),篩選差異表達(dá)miRNAs,行qPCR驗(yàn)證。(9)生物信息學(xué)分析及雙熒光素酶檢測(cè)根據(jù)芯片篩選差異表達(dá)結(jié)果(hsa-miR-26a-5p),通過生物信息學(xué)網(wǎng)站(http://www.microma.org.)查詢預(yù)測(cè) miRNA-26a-5p 可結(jié)合 TAB3-3'UTR。將hsa-miR-26a-5pmimics(mimics NC 為對(duì)照)與預(yù)測(cè)靶基因 TAB3-3'UTR 野生型和TAB3-3'UTR的突變型分別用熒光素酶報(bào)告載體瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染AF細(xì)胞,檢測(cè)雙熒光素酶活性,驗(yàn)證miR-26a-5p抑制靶基因TAB3翻譯水平。(10)質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染以miRNA-26a-5p系列為模板,構(gòu)建過表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染AF細(xì)胞[AF-ZsGreen-Puro-miRNA-26a-5p],以空載質(zhì)粒[AF-ZsGreen-Puro]為對(duì)照;構(gòu)建表達(dá)抑制載體,轉(zhuǎn)染 hOMF 細(xì)胞[hOMF-ZsGreen-Puro-miR-26a-5p inhibitor],空載質(zhì)粒[hOMF-ZsGreen-Puro]為對(duì)照。(11)免疫印跡檢測(cè)成纖維細(xì)胞TAB3、NF-κB(p65,p-p65)及β-SMA表達(dá)。(12)所得數(shù)據(jù)結(jié)果都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)統(tǒng)計(jì)。兩組間比較用t檢驗(yàn),多組間比較用方差分析,p0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p0.01統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異。采用 Graphpad Prism 5.0(Graphpad software.San Diego,SA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。[結(jié)果](1)口腔舌鱗癌細(xì)胞Cal-27分泌上清誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化成纖維細(xì)胞經(jīng)過Cal-27細(xì)胞分泌上清刺激后,其生長(zhǎng)速度加快,接觸抑制消失;細(xì)胞內(nèi)微管及致密斑增加;活化標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)增加,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);PDGFR-β受體表達(dá)增加。(2)口腔舌鱗癌細(xì)胞高分泌PDGF-BB因子蛋白芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)口腔舌鱗癌細(xì)胞上清中PDGF-BB因子濃度是正�？谇火つど掀ぜ�(xì)胞上清中的5.7倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。用ELISA檢測(cè)PDGF-BB因子,結(jié)果與芯片雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。(3)PDGF-BB誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增強(qiáng)趨化因子CCL25的分泌采用趨化因子芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn),hOMF細(xì)胞經(jīng)PDGF-BB刺激后細(xì)胞上清中趨化因子CCL25濃度明顯升高,是對(duì)照組的1.8倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);行q-PCR和ELISA進(jìn)一步檢測(cè),與芯片雜交結(jié)果相似,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。(4)PDGF-BB誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞下調(diào)miR-26a表達(dá)芯片檢測(cè)篩選發(fā)現(xiàn),hOMF細(xì)胞經(jīng)PDGF-BB刺激后hsa-miR-26a-5p表達(dá)與對(duì)照組相比出現(xiàn)明顯下調(diào)(p0.05)。行qPCR進(jìn)一步檢測(cè)得到相同的結(jié)果,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(5)口腔舌鱗癌誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞TAB3高表達(dá)、NF-κB磷酸化。hOMF細(xì)胞經(jīng)Cal-27細(xì)胞上清刺激后,免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TAB3和NF-κ B磷酸化蛋白(p-p65)表達(dá)明顯上調(diào),與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。Cal-27細(xì)胞上清刺激的同時(shí),分別加入PDGF-BB抗體阻斷劑和PDGFR-β受體抑制劑后,與對(duì)照組相比,TAB3和NF-κB磷酸化蛋白表達(dá)上調(diào)均受抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(6)miR-26a-5p 負(fù)性調(diào)控 TAB3生物信息學(xué)分析顯示miRNA-26a-5p可結(jié)合TAB3-3'UTR。雙熒光素酶進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在活化成纖維細(xì)胞中,TAB3-WT-hsa-miR-26a組熒光值較TAB3-WT-mimicsNC組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),而miRNA-26a-5p對(duì)含TAB3-3'UTR mutant片段的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)水平無抑制作用。(7)miR-26a-5p功能缺失促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn) hOMF-hsa-miR-26a-5p inhibitor 組細(xì)胞的α-SMA、TAB3和NF-κB(p-p65)蛋白表達(dá)量與hOMF-ZsGreen-Puro組細(xì)胞相比明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。經(jīng) PDGF-BB 刺激后,hOMF-hsa-miR-26a-5p inhibitor組細(xì)胞較空白組α-SMA、TAB3和NF--κB(p-p65)蛋白表達(dá)量明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。(8)miR-26a-5p功能獲得逆轉(zhuǎn)及抑制成纖維細(xì)胞活化免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AF-hsa-miR-26a-5p組細(xì)胞的α-SMA、TAB3、NF-κB蛋白表達(dá)量與AFs-ZsGreen-Puro組細(xì)胞相比明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) AF-ZsGreen-Puro 組細(xì)胞經(jīng) PDGF-BB 刺激后,α-SMA、TAB3和 NF-κB(p-p65)蛋白表達(dá)量明顯上調(diào);而 AF-ZsGreen-Puro-hsa-miR-26a-5p 組細(xì)胞經(jīng)PDGF-BB刺激后,α-SMA、TAB3、NF-κB(p-p65)蛋白表達(dá)量與AF-ZsGreen-Puro組相比上調(diào)明顯減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。[結(jié)論]PDGF-BB是口腔黏膜成纖維細(xì)胞活化關(guān)鍵誘導(dǎo)因子,其可能通過與其受體結(jié)合,下調(diào)miR-26a-5p表達(dá),解除miR-26a-5p對(duì)TAB3靶向抑制作用,從而激活NF-κB信號(hào)通路,誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化。
【學(xué)位單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R739.8
【部分圖文】：

?處理３次后，倒置顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞，結(jié)果與對(duì)照組相比，活化的成纖維??細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快及接觸抑制消失（圖１）。??ｈＯＭＫ?ｓｕｐ?—?＋?—??Ｃａｌ－２７?ｓｕｐ?—?—?＋??■■圓??圖１成纖維細(xì)胞倒置顯微鏡觀察（ｘｌＯＯ）??以上各組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，經(jīng)丙酮固定、ＨＥ染色、封片等處理后，光鏡下??觀察成纖維細(xì)胞的形態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)Ｃａｌ－２７細(xì)胞上清刺激后成纖維細(xì)胞的??胞漿突起增多，核深染，而空白組和ｈＯＭＫ細(xì)胞上清組成纖維細(xì)胞的形態(tài)無明??顯變化（圖２）。??ｈＯＭＫ?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ?—?＋?—??Ｃａｌ－２７?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ?—?—?＋??：＞Ｖ?＊ｖ?１??，．ｖ．？二ｒ?：?．?－?Ｖ?：－?＾??？?＾Ｖ＊?ｒ－ｖ?／■＇ＶｖｒＶ－??圖２成纖維細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)光鏡觀察（ＨＥ染色，ｘｌＯＯ）??同時(shí)，提取以上各組細(xì)胞經(jīng)２．５％戊二醛固定、脫水、包埋、固化、切片、染??色和透射電子顯微鏡下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ｃａｌ－２７細(xì)胞分泌上清刺激的成纖維細(xì)內(nèi)??的微管及致密斑增加

觀察成纖維細(xì)胞的形態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)Ｃａｌ－２７細(xì)胞上清刺激后成纖維細(xì)胞的??胞漿突起增多，核深染，而空白組和ｈＯＭＫ細(xì)胞上清組成纖維細(xì)胞的形態(tài)無明??顯變化（圖２）。??ｈＯＭＫ?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ?—?＋?—??Ｃａｌ－２７?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ?—?—?＋??：＞Ｖ?＊ｖ?１??，．ｖ．？二ｒ?：?．?－?Ｖ?：－?＾??？?＾Ｖ＊?ｒ－ｖ?／■＇ＶｖｒＶ－??圖２成纖維細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)光鏡觀察（ＨＥ染色，ｘｌＯＯ）??同時(shí)，提取以上各組細(xì)胞經(jīng)２．５％戊二醛固定、脫水、包埋、固化、切片、染??色和透射電子顯微鏡下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ｃａｌ－２７細(xì)胞分泌上清刺激的成纖維細(xì)內(nèi)??的微管及致密斑增加，而空白組和ｈＯＭＫ細(xì)胞上清刺激組的成纖維細(xì)無明顯變??化。以上結(jié)果提示舌鱗癌細(xì)胞分泌的上清能影響成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)結(jié)構(gòu)的??變化。??２７??

２．成纖維細(xì)胞ａ－ＳＭＡ表達(dá)檢測(cè)結(jié)果??經(jīng)過舌鱗癌細(xì)胞分泌上清的誘導(dǎo)，成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)、形態(tài)及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)都??發(fā)生了明顯的變化，表現(xiàn)為活化的趨勢(shì)。為了進(jìn)一步探索舌鱗癌細(xì)胞分泌上清能??否誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化，用Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ檢測(cè)成纖維細(xì)胞活化的標(biāo)志蛋白ａ－ＳＭＡ??表達(dá)的情況，使用含有２／３完全培養(yǎng)基和１／３?Ｃａｌ－２７細(xì)胞分泌上清或ｈＯＭＫ細(xì)胞??分泌上清的條件培養(yǎng)基分別常規(guī)培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，經(jīng)過７２ｈ培養(yǎng)后傳代，連續(xù)傳??代３次后，分別提取細(xì)胞總蛋白行免疫印跡檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ｃａｌ－２７細(xì)胞分泌上??清刺激的成纖維細(xì)ａ－ＳＭＡ蛋白條帶較對(duì)空白組表達(dá)增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義??（ｐ＜０．０５），而ｈＯＭＫ細(xì)胞上清刺激的成纖維細(xì)胞表達(dá)ａ－ＳＭＡ免疫印跡結(jié)果較空??白組無明顯的差異（圖４、５、表１）。該結(jié)果說明舌癌細(xì)胞分泌上清可使成纖維??細(xì)胞的活化標(biāo)志蛋白ａ－ＳＭＡ表達(dá)增強(qiáng)，提示舌鱗癌細(xì)胞分泌上清具有活化成纖??維細(xì)胞的作用。??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2885189