發(fā)布時間：2020-11-15 20:50

　　 [目的]腫瘤演進過程中,腫瘤細胞與基質細胞的相互作用備受關注。與正常成纖維細胞相比,腫瘤基質中的成纖維細胞即癌相關成纖維細胞處于活化狀態(tài),但其活化機制尚不明了。本研究通過建立口腔癌細胞與成纖維細胞共培養(yǎng)模型,探索血小板源性生長因子BB及其受體(PDGF-BB/PDGFR-β)介導癌細胞誘導成纖維活化的作用及相關機制,從基質角度闡明腫瘤演進機理并詮釋癌細胞與基質成纖維細胞的內在關系及其分子事件,為探索通過干預PDGF-BB/PDGFR-β通路防治腫瘤提供實驗依據。[方法](1)細胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)正常人口腔黏膜角質化細胞hOMK(Normal human Oral Mucosa(P2)500K Keratinocytes cells,新加坡 Cell Research Corp)、人口腔舌鱗癌細胞Cal-27(美國ATCC)、正常人口腔黏膜成纖維細胞hOMF(Normal human Oral Mucosa(P3)500K fibroblast cells,新加坡 CellResearch Corp)。(2)上皮細胞差異分泌因子篩選用RayBio QAH-CAA-1000芯片雜交技術檢測hOMK及Cal-27細胞分泌因子,篩選差異分泌因子,并用ELISA驗證。(3)條件培養(yǎng)基的制備hOMK及Cal-27細胞分別接種至150ml培養(yǎng)瓶,當細胞生長匯合達約80%時,更換新的完全培養(yǎng)基持續(xù)孵育24h,收集細胞上清液,4℃、15000g離心30min去除細胞碎片,0.22μm直徑微孔濾膜除菌,-20℃保存以備用。(4)成纖維細胞活化誘導用含有30ng/ml PDGF-BB因子的完全培養(yǎng)基或1/3體積Cal-27細胞上清和2/3體積的完全培養(yǎng)基對成纖維細胞進行培養(yǎng),每3天傳代處理一次,傳代處理3次后,對各組成纖維細胞生物學特性進行分析,獲得活化的成纖維細胞(AF)。(5)在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài),HE染色后光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài),透射電鏡觀察微管及致密斑等亞細胞結構。(6)免疫熒光染色檢測成纖維細胞PDGFR-β的表達。(7)成纖維細胞趨化因子分泌檢測趨化因子芯片檢測正常成纖維細胞和活化成纖維細胞分泌的趨化因子,篩選差異分泌的趨化因子,行ELISA和qPCR驗證。(8)成纖維細胞miRNAs表達檢測Human Cancer Focus microRNATarget mRNA PCR Array 芯片檢測正常成纖維細胞和活化成纖維細胞miRNAs表達,篩選差異表達miRNAs,行qPCR驗證。(9)生物信息學分析及雙熒光素酶檢測根據芯片篩選差異表達結果(hsa-miR-26a-5p),通過生物信息學網站(http://www.microma.org.)查詢預測 miRNA-26a-5p 可結合 TAB3-3'UTR。將hsa-miR-26a-5pmimics(mimics NC 為對照)與預測靶基因 TAB3-3'UTR 野生型和TAB3-3'UTR的突變型分別用熒光素酶報告載體瞬時共轉染AF細胞,檢測雙熒光素酶活性,驗證miR-26a-5p抑制靶基因TAB3翻譯水平。(10)質粒構建及轉染以miRNA-26a-5p系列為模板,構建過表達載體,轉染AF細胞[AF-ZsGreen-Puro-miRNA-26a-5p],以空載質粒[AF-ZsGreen-Puro]為對照;構建表達抑制載體,轉染 hOMF 細胞[hOMF-ZsGreen-Puro-miR-26a-5p inhibitor],空載質粒[hOMF-ZsGreen-Puro]為對照。(11)免疫印跡檢測成纖維細胞TAB3、NF-κB(p65,p-p65)及β-SMA表達。(12)所得數據結果都以均數±標準差(Mean±SD)統(tǒng)計。兩組間比較用t檢驗,多組間比較用方差分析,p0.05有統(tǒng)計學意義,p0.01統(tǒng)計學有顯著差異。采用 Graphpad Prism 5.0(Graphpad software.San Diego,SA)對數據進行處理和分析。[結果](1)口腔舌鱗癌細胞Cal-27分泌上清誘導成纖維細胞活化成纖維細胞經過Cal-27細胞分泌上清刺激后,其生長速度加快,接觸抑制消失;細胞內微管及致密斑增加;活化標志蛋白α-SMA表達增加,與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);PDGFR-β受體表達增加。(2)口腔舌鱗癌細胞高分泌PDGF-BB因子蛋白芯片檢測發(fā)現口腔舌鱗癌細胞上清中PDGF-BB因子濃度是正常口腔黏膜上皮細胞上清中的5.7倍,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。用ELISA檢測PDGF-BB因子,結果與芯片雜交實驗結果相似,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。(3)PDGF-BB誘導成纖維細胞增強趨化因子CCL25的分泌采用趨化因子芯片檢測發(fā)現,hOMF細胞經PDGF-BB刺激后細胞上清中趨化因子CCL25濃度明顯升高,是對照組的1.8倍,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);行q-PCR和ELISA進一步檢測,與芯片雜交結果相似,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。(4)PDGF-BB誘導成纖維細胞下調miR-26a表達芯片檢測篩選發(fā)現,hOMF細胞經PDGF-BB刺激后hsa-miR-26a-5p表達與對照組相比出現明顯下調(p0.05)。行qPCR進一步檢測得到相同的結果,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。(5)口腔舌鱗癌誘導成纖維細胞TAB3高表達、NF-κB磷酸化。hOMF細胞經Cal-27細胞上清刺激后,免疫印跡檢測發(fā)現TAB3和NF-κ B磷酸化蛋白(p-p65)表達明顯上調,與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。Cal-27細胞上清刺激的同時,分別加入PDGF-BB抗體阻斷劑和PDGFR-β受體抑制劑后,與對照組相比,TAB3和NF-κB磷酸化蛋白表達上調均受抑制,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。(6)miR-26a-5p 負性調控 TAB3生物信息學分析顯示miRNA-26a-5p可結合TAB3-3'UTR。雙熒光素酶進一步檢測發(fā)現在活化成纖維細胞中,TAB3-WT-hsa-miR-26a組熒光值較TAB3-WT-mimicsNC組低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),而miRNA-26a-5p對含TAB3-3'UTR mutant片段的熒光素酶報告基因表達水平無抑制作用。(7)miR-26a-5p功能缺失促進成纖維細胞活化免疫印跡檢測發(fā)現 hOMF-hsa-miR-26a-5p inhibitor 組細胞的α-SMA、TAB3和NF-κB(p-p65)蛋白表達量與hOMF-ZsGreen-Puro組細胞相比明顯上調,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。經 PDGF-BB 刺激后,hOMF-hsa-miR-26a-5p inhibitor組細胞較空白組α-SMA、TAB3和NF--κB(p-p65)蛋白表達量明顯上調,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。(8)miR-26a-5p功能獲得逆轉及抑制成纖維細胞活化免疫印跡檢測發(fā)現AF-hsa-miR-26a-5p組細胞的α-SMA、TAB3、NF-κB蛋白表達量與AFs-ZsGreen-Puro組細胞相比明顯下調,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。進一步發(fā)現 AF-ZsGreen-Puro 組細胞經 PDGF-BB 刺激后,α-SMA、TAB3和 NF-κB(p-p65)蛋白表達量明顯上調;而 AF-ZsGreen-Puro-hsa-miR-26a-5p 組細胞經PDGF-BB刺激后,α-SMA、TAB3、NF-κB(p-p65)蛋白表達量與AF-ZsGreen-Puro組相比上調明顯減弱,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。[結論]PDGF-BB是口腔黏膜成纖維細胞活化關鍵誘導因子,其可能通過與其受體結合,下調miR-26a-5p表達,解除miR-26a-5p對TAB3靶向抑制作用,從而激活NF-κB信號通路,誘導成纖維細胞活化。
【學位單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R739.8
【部分圖文】：

?處理３次后，倒置顯微鏡下觀察成纖維細胞，結果與對照組相比，活化的成纖維??細胞生長速度加快及接觸抑制消失（圖１）。??ｈＯＭＫ?ｓｕｐ?—?＋?—??Ｃａｌ－２７?ｓｕｐ?—?—?＋??■■圓??圖１成纖維細胞倒置顯微鏡觀察（ｘｌＯＯ）??以上各組細胞進行細胞爬片，經丙酮固定、ＨＥ染色、封片等處理后，光鏡下??觀察成纖維細胞的形態(tài)變化，結果發(fā)現經Ｃａｌ－２７細胞上清刺激后成纖維細胞的??胞漿突起增多，核深染，而空白組和ｈＯＭＫ細胞上清組成纖維細胞的形態(tài)無明??顯變化（圖２）。??ｈＯＭＫ?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ?—?＋?—??Ｃａｌ－２７?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ?—?—?＋??：＞Ｖ?＊ｖ?１??，．ｖ．？二ｒ?：?．?－?Ｖ?：－?＾??？?＾Ｖ＊?ｒ－ｖ?／■＇ＶｖｒＶ－??圖２成纖維細胞細胞形態(tài)光鏡觀察（ＨＥ染色，ｘｌＯＯ）??同時，提取以上各組細胞經２．５％戊二醛固定、脫水、包埋、固化、切片、染??色和透射電子顯微鏡下觀察，結果發(fā)現Ｃａｌ－２７細胞分泌上清刺激的成纖維細內??的微管及致密斑增加

觀察成纖維細胞的形態(tài)變化，結果發(fā)現經Ｃａｌ－２７細胞上清刺激后成纖維細胞的??胞漿突起增多，核深染，而空白組和ｈＯＭＫ細胞上清組成纖維細胞的形態(tài)無明??顯變化（圖２）。??ｈＯＭＫ?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ?—?＋?—??Ｃａｌ－２７?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ?—?—?＋??：＞Ｖ?＊ｖ?１??，．ｖ．？二ｒ?：?．?－?Ｖ?：－?＾??？?＾Ｖ＊?ｒ－ｖ?／■＇ＶｖｒＶ－??圖２成纖維細胞細胞形態(tài)光鏡觀察（ＨＥ染色，ｘｌＯＯ）??同時，提取以上各組細胞經２．５％戊二醛固定、脫水、包埋、固化、切片、染??色和透射電子顯微鏡下觀察，結果發(fā)現Ｃａｌ－２７細胞分泌上清刺激的成纖維細內??的微管及致密斑增加，而空白組和ｈＯＭＫ細胞上清刺激組的成纖維細無明顯變??化。以上結果提示舌鱗癌細胞分泌的上清能影響成纖維細胞的生長和形態(tài)結構的??變化。??２７??

２．成纖維細胞ａ－ＳＭＡ表達檢測結果??經過舌鱗癌細胞分泌上清的誘導，成纖維細胞的生長、形態(tài)及亞細胞結構都??發(fā)生了明顯的變化，表現為活化的趨勢。為了進一步探索舌鱗癌細胞分泌上清能??否誘導成纖維細胞活化，用Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ檢測成纖維細胞活化的標志蛋白ａ－ＳＭＡ??表達的情況，使用含有２／３完全培養(yǎng)基和１／３?Ｃａｌ－２７細胞分泌上清或ｈＯＭＫ細胞??分泌上清的條件培養(yǎng)基分別常規(guī)培養(yǎng)成纖維細胞，經過７２ｈ培養(yǎng)后傳代，連續(xù)傳??代３次后，分別提取細胞總蛋白行免疫印跡檢測，結果發(fā)現Ｃａｌ－２７細胞分泌上??清刺激的成纖維細ａ－ＳＭＡ蛋白條帶較對空白組表達增強，差異具有統(tǒng)計學意義??（ｐ＜０．０５），而ｈＯＭＫ細胞上清刺激的成纖維細胞表達ａ－ＳＭＡ免疫印跡結果較空??白組無明顯的差異（圖４、５、表１）。該結果說明舌癌細胞分泌上清可使成纖維??細胞的活化標志蛋白ａ－ＳＭＡ表達增強，提示舌鱗癌細胞分泌上清具有活化成纖??維細胞的作用。??
【參考文獻】

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1 曾炳恬;;PDGF-BB及其受體PDG-FR-β的表達與非小細胞肺癌淋巴道轉移的相關性研究[J];當代醫(yī)學;2014年28期

2 劉國成;楊守華;王澤華;;子宮頸癌癌前病變和早期子宮頸鱗癌組織中血小板源性生長因子的表達及其臨床意義[J];中華婦產科雜志;2011年11期

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本文編號：2885189