目的:分析Twist在胰腺癌細(xì)胞株和胰腺癌組織中的表達(dá),再通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),觀察上調(diào)和下調(diào)Twist對(duì)胰腺癌細(xì)胞新生血管形成的影響,并試圖闡述Twist與VEGFA在胰腺癌中的相互關(guān)系,為基于靶向調(diào)控Twist在胰腺癌治療中的應(yīng)用提供有用的實(shí)驗(yàn)參考。方法:利用免疫組化和RT-PCR方法檢測(cè)Twist和VEGFA在胰腺癌組織和胰腺癌旁正常組織中的表達(dá),免疫組化分析胰腺癌組織中CD34的表達(dá);利用慢病毒建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和沉默Twist的胰腺癌細(xì)胞株并檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)株中VEGFA和Twist蛋白的表達(dá)、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞侵襲和其CM(conditioned medium,條件培養(yǎng)基)對(duì)體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)侵襲和血管新生的影響;利用沉默Twist及其對(duì)照的穩(wěn)轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞株建立人胰腺癌裸鼠原位移植瘤模型,觀察下調(diào)Twist對(duì)裸鼠胰腺腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移情況,明膠-氧化鉛血管造影法觀察Twist對(duì)胰腺腫瘤血管生長(zhǎng)的影響,免疫組化法檢測(cè)Ki-67、CD34、VEGFA和Twist在兩組胰腺腫瘤組織中的表達(dá)。結(jié)果:Twist和VEGFA在胰腺癌組織中的表達(dá)較正常胰腺組織明顯升高,Twist mRNA的表達(dá)與胰腺癌臨床病理分期相關(guān),Twist和CD34以及VEGFA在胰腺癌組織中的表達(dá)均呈正相關(guān);成功建立過(guò)表達(dá)Twist的穩(wěn)轉(zhuǎn)胰腺癌Capan-1細(xì)胞株和沉默Twist的穩(wěn)轉(zhuǎn)胰腺癌Bxpc-3細(xì)胞株,過(guò)表達(dá)Twist可促進(jìn)VEGFA在Capan-1細(xì)胞中的表達(dá),而沉默Twist可抑制VEGFA在Bxpc-3細(xì)胞中的表達(dá);上調(diào)Twist在Capan-1細(xì)胞中的表達(dá)后,Capan-1細(xì)胞生長(zhǎng)明顯被促進(jìn),而下調(diào)Twist在Bxpc-3中的表達(dá)后可抑制體外Bxpc-3細(xì)胞增殖;過(guò)表達(dá)Twist可促進(jìn)Capan-1細(xì)胞對(duì)體外HUVECs侵襲和血管新生誘導(dǎo)作用,而沉默Twist對(duì)上述作用產(chǎn)生抑制作用;下調(diào)Twist在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)后可顯著延長(zhǎng)裸鼠生存期,抑制裸鼠胰腺腫瘤生長(zhǎng),并減少轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量;抑制Twist在胰腺癌中的表達(dá)可有效抑制體內(nèi)胰腺癌組織血管生長(zhǎng),同時(shí)抑制Ki-67、CD34和VEGFA的陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)論:通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Twist與胰腺癌新生血管生長(zhǎng)關(guān)系密切,抑制Twist在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)可有效抑制體內(nèi)外胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和血管新生,VEGFA和Twist可能在胰腺癌血管生長(zhǎng)過(guò)程中起到協(xié)同作用,而Twist有望成為治療胰腺癌新的作用靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R735.9
【部分圖文】：

個(gè)反應(yīng)體系中的Ｃｔ值與初始ｍＲＮＡ表達(dá)量的對(duì)數(shù)值存在一定的線性關(guān)系，初始??表達(dá)量越多則Ｃｔ值越小。為此，通過(guò)已知初始表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)品即可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲??線（圖１－２），橫坐標(biāo)表示為初始表達(dá)量的對(duì)數(shù)值，而Ｃｔ值代表為縱坐標(biāo)，利??用目的基因的Ｃｔ值后再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)曲線中即可計(jì)算出目的基因的初始表達(dá)量。??１７??

ｌａ?？?２２??Ｃｙｃｌｅ??圖１－１：實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ反應(yīng)擴(kuò)增曲線圖。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｌｏｔ．?Ｂａｓｅｌｉｎｅ－ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｖｅｒｓｕｓ?ｎｕｍｂｅｒ?ｏｆ?ＰＣＲ?ｃｙｃｌｅｓ．??熒光擴(kuò)增曲線包括熒光背景信號(hào)階段、熒光信號(hào)指數(shù)倍增階段、熒光信號(hào)??線性增長(zhǎng)階段及平臺(tái)期這四個(gè)階段。熒光背景信號(hào)階段中的熒光背景信號(hào)將擴(kuò)??增的熒光信號(hào)覆蓋，從而難以準(zhǔn)確獲取目的基因表達(dá)量。線性期和平臺(tái)期的目??的基因產(chǎn)物不再以指數(shù)式倍增，難以通過(guò)監(jiān)測(cè)ＰＣＲ產(chǎn)物量反映初始ＤＮＡ表達(dá)??量，只有在熒光信號(hào)指數(shù)倍增階段，ＰＣＲ產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間呈??線性關(guān)系。為了對(duì)這種線性關(guān)系進(jìn)行分析，需要了解實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ反應(yīng)中??的兩個(gè)重要參數(shù)：熒光閾值和Ｃｔ值。前者是一個(gè)人為設(shè)定在任意熒光信號(hào)倍增??階段上的值，一般將其設(shè)置在４－１２個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的１２倍左右區(qū)間。Ｃｔ值??是指當(dāng)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)預(yù)先設(shè)定的閾值時(shí)所發(fā)生的ＰＣＲ循環(huán)次數(shù)，每??個(gè)反應(yīng)體系中的Ｃｔ值與初始ｍＲＮＡ表達(dá)量的對(duì)數(shù)值存在一定的線性關(guān)系，初始??表達(dá)量越多則Ｃｔ值越小。為此

Ｌｏｇ?Ｓｔａｒｔｉｎｇ?Ｑｕａａｔｉｆ／．ｃｃｐｙ?ｎｕｍｂｅｒ??令?ＳＹＢＲ?Ｅ＝?９９．９５Ｓ?ＲＡ２＝１．０００?ｓ＇ｏｐｅ＝－Ｓ．?３２４?＞－１〇１＝３４．?Ｓ７２??圖１－２：實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｉｎ?ｑＲＴ－ＰＣＲ．??１．２．１．２實(shí)驗(yàn)步驟??（１）
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本文編號(hào)：2884799