研究背景和目的肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,其死亡率在所有惡性腫瘤中排在第一位。而肺腺癌是目前發(fā)病率最高的一類肺癌。癌基因與細(xì)胞生長密切相關(guān),可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化。抑癌基因是一類存在于正常細(xì)胞內(nèi),可抑制細(xì)胞生長并具有潛在抑癌作用的基因,抑制腫瘤細(xì)胞過度生長、增殖從而抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。癌基因和抑癌基因的調(diào)節(jié)失衡是腫瘤發(fā)生以及進(jìn)展極其重要的原因。VPS33B是Sec1/Munc-18(SM)蛋白家族成員之一,其報道聚焦于關(guān)節(jié)攣縮、腎功能不全和膽汁淤積綜合征(ARC syndrome)和巨核細(xì)胞與血小板α-顆粒的生物合成等疾病上。目前尚無VPS33B在腫瘤發(fā)病機制機理以及與腫瘤預(yù)后相關(guān)方面的報道。MicroRNAs(miRNAs)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22到25個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA,其密切參與到腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。miR-192-3p在腫瘤中的功能和機制目前尚無任何報道。研究內(nèi)容與方法1.VPS33B裸鼠肝包膜轉(zhuǎn)移模型的建立利用裸鼠肝包膜轉(zhuǎn)移模型驗證VPS33B體內(nèi)抑制肺腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力。2.miR-192-3p抑制肺腺癌增殖及轉(zhuǎn)移(1)利用miRNA芯片檢測過表達(dá)VPS33B細(xì)胞株中miRNAs差異性表達(dá);并用熒光定量PCR方法鑒定所選定miRNA在過表達(dá)VPS33B肺腺癌細(xì)胞中表達(dá)情況;(2)體外功能實驗驗證所選定的miR-192-3p對肺腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響。3.預(yù)測并驗證miR-192-3p的靶基因(1)用因特網(wǎng)上的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-192-3p的直接靶基因;(2)蛋白免疫印跡(Western Blot)及實時熒光定量PCR檢測mimics過表達(dá)以及用inhibitor干擾miR-192-3p的細(xì)胞中蛋白和mRNA水平的靶基因表達(dá)量的改變;(3)利用雙熒光素酶報告(Luciferase Activity Report)實驗驗證確定miR-192-3p 靶基因;(4)體外細(xì)胞功能實驗檢測過表達(dá)其目的基因后miR-192-3p對肺腺癌細(xì)胞作用的影響。4.生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測并實驗證明p53啟動子區(qū)所結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子(1)熒光定量PCR檢測過質(zhì)粒表達(dá)p53的肺腺癌細(xì)胞A549和H1975中miR-192-3p及其靶基因的表達(dá)量改變;(2)Western Blot驗證p53對VPS33B所調(diào)控的信號通路影響;(3)在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和ChIP實驗預(yù)測并驗證p53啟動子區(qū)所結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子;qPCR、Western Blot和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測上述轉(zhuǎn)錄因子對p53啟動子活性影響。5.VPS33B與NESG1相互作用研究(1)用熒光定量PCR和Western Blot檢測過表達(dá)VPS33B肺腺癌細(xì)胞中NESG1的表達(dá)情況;(2)利用顯微共聚焦、免疫共沉淀等實驗確認(rèn)VPS33B與NESG1是否有相互作用;(3)利用在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測NESG1的啟動子區(qū)域所結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子;(4)CHIP和EMSA實驗驗證上述預(yù)測的NESG1啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點是否有效;進(jìn)一步用熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測上述轉(zhuǎn)錄因子對NESG1啟動子活性影響;驗證NESG1對VPS33B所調(diào)控信號通路影響。結(jié)果1.肝包膜轉(zhuǎn)移模型進(jìn)一步驗證VPS33B可在體內(nèi)抑制肺腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移;2.miR-192-3p在過表達(dá)VPS33B肺腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),并可在體外發(fā)揮抑制肺腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移作用;3.CCNB1為miR-192-3p的直接靶基因,并受到其負(fù)性調(diào)控;過表達(dá)CCNB1可以逆轉(zhuǎn)miR-192-3p對肺腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用;4.P53促進(jìn)miR-192-3p表達(dá),降低CCNB1表達(dá),并抑制VPS33B調(diào)控的PI3K/AKT通路;c-Myc直接結(jié)合到p53的啟動子區(qū)并抑制其轉(zhuǎn)錄;5.VPS33B與NESG1在肺腺癌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中存在共定位并相互作用,并且VPS33B通過抑制PI3K/AKT/c-Jun信號通路促進(jìn)NESG1轉(zhuǎn)錄。結(jié)論VPS33B通過抑制PI3K/AKT/c-Jun信號通路,誘導(dǎo)NESG1表達(dá),負(fù)性調(diào)控c-Myc,從而降低c-Myc與p53啟動子結(jié)合,上調(diào)了 p53表達(dá),因此轉(zhuǎn)錄了抑癌基因miR-192-3p表達(dá),最后靶向CCNB1發(fā)揮了抑制肺腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2
【部分圖文】：

?Ａ５４９?Ｈ１９７５??圖１－１熒光定量ＰＣＲ鑒定Ａ５４９－ＶＰＳ３３Ｂ及Ｈ１９７５－ＶＰＳ３３Ｂ細(xì)胞中ＶＰＳ３３Ｂ過表達(dá)量??Ｆｉｇｕｒｅｌ－１．?Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ?ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＶＰＳ３３Ｂ?ｉｎ?Ａ５４９－ＶＰＳ３３Ｂ?ａｎｄ?Ｈ１９７５－ＶＰＳ３３Ｂ??ｃｅｌｌｓ?ｂｙ?Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ?ＰＣＲ??２．?ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ?實驗檢測?Ａ５４９－ＶＰＳ３３Ｂ?及?Ｈ１９７５－ＶＰＳ３３Ｂ?細(xì)胞中?ＶＰＳ３３Ｂ??過表達(dá)量。??我們進(jìn)一步用Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ方法在蛋白水平檢測Ａ５４９－ＶＰＳ３３Ｂ及??Ｈ１９７５－ＶＰＳ３３Ｂ細(xì)胞中ＶＰＳ３３Ｂ過表達(dá)量，結(jié)果顯示與空載細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染了??ＶＰＳ３３Ｂ慢病毒的Ａ５４９及Ｈ１９７５細(xì)胞中ＶＰＳ３３Ｂ表達(dá)量明顯上調(diào)。檢測結(jié)果??如下圖所示：??１４??

圖２－１．部分ｍｉＲＮＡｓ芯片數(shù)據(jù)熱圖??Ｆｉｇｕｒｅ２－１．?Ｔｈｅ?ｈｅａｔｍａｐ?ｅｄｉｔｉｎｇ?ｂｙ?ｔｈｅ?ｄａｔａ?ｆｒｏｍ?ｍｉＲＮＡ?ｃ３２??

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【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 方志文;牟召霞;王新艷;翟玉棟;;p53與c-myc和cyclin B_1在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)及意義[J];中華腫瘤防治雜志;2007年04期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 劉艷;VPS33B抑制肺癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

本文編號：2881233