人類基因組計(jì)劃發(fā)現(xiàn),人體大概有23,000個編碼基因,遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于轉(zhuǎn)錄出來的蛋白質(zhì)種類。究其原因,超過百分之九十以上的人類基因存在著RNA可變剪接,從而豐富了蛋白質(zhì)種類。生物體通過精細(xì)調(diào)控基因的可變剪接,能夠?qū)Νh(huán)境壓力作出及時準(zhǔn)確的應(yīng)答,從而維持了生物學(xué)穩(wěn)定性,甚至可以為進(jìn)化提供物質(zhì)基礎(chǔ)。在腫瘤發(fā)展中,基因異常的可變剪接往往會減少抑癌轉(zhuǎn)錄本的表達(dá),同時伴隨著促癌轉(zhuǎn)錄本的增加。隨著二代測序技術(shù)的普及,越來越多的異�？勺兗艚邮艿搅岁P(guān)注。作為一種新型的腫瘤標(biāo)志物,發(fā)生異常剪接的基因往往涉及腫瘤血管生成,侵襲遷移,免疫逃避以及細(xì)胞代謝等多種癌癥通路。SR蛋白家族(Serine/arginine-rich RNA binding protein)屬于絲氨酸-精氨酸富集蛋白,它在前體RNA的剪接過程中發(fā)揮著極為重要的作用。SR蛋白能夠識別結(jié)合前體RNA上的剪接元件,繼而招募組裝剪接體從而促進(jìn)或抑制剪接事件的發(fā)生。腫瘤中,SR蛋白的異常表達(dá)導(dǎo)致RNA異常剪接,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移,抑制腫瘤的凋亡。例如,作為SR蛋白家族的主要成員之一,SRSF6在多種腫瘤中存在著拷貝數(shù)的擴(kuò)增,在皮膚癌中,高表達(dá)水平SRSF6能夠?qū)е录?xì)胞黏合素C(TNC)基因的異�？勺兗艚�,從而促進(jìn)皮膚癌的增殖。本實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果表明,長鏈非編碼RNALINC01133能夠通過與SRSF6蛋白結(jié)合從而抑制其誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用,然而SRSF6在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的下游靶點(diǎn),及其如何通過與下游靶點(diǎn)的結(jié)合進(jìn)行剪接作用等一系列的機(jī)制目前尚不清楚。為此,本課題以結(jié)直腸癌為模型,圍繞以下幾點(diǎn)展開:探討SRSF6在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能;鑒定SRSF6調(diào)控的下游剪接靶基因以及SRSF6識別結(jié)合的RNA基序;分析鑒別SRSF6發(fā)揮剪接調(diào)控的結(jié)構(gòu)域并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)及篩選評價。1、SRSF6在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義通過TCGA基因拷貝數(shù)數(shù)據(jù)集,發(fā)現(xiàn)SRSF6基因拷貝數(shù)在結(jié)直腸癌病人中顯著增加,SRSF6高拷貝數(shù)與其mRNA表達(dá)量成正相關(guān),并且SRSF6高表達(dá)的病人預(yù)后較差;通過逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測本實(shí)驗(yàn)室311例配對結(jié)直腸癌病人樣本庫,發(fā)現(xiàn)SRSF6在結(jié)直腸癌腫瘤樣本中高表達(dá),并且高表達(dá)的病人預(yù)后顯著較差。為了進(jìn)一步探索SRSF6的生物學(xué)功能,在六種結(jié)直腸癌細(xì)胞系中敲低SRSF6表達(dá)后,通過CCK8,transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn),軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)SRSF6敲低以后細(xì)胞的侵襲遷移以及增殖克隆形成能力均顯著下降,而過表達(dá)同義突變的SRSF6質(zhì)粒能夠恢復(fù)以上腫瘤細(xì)胞生物學(xué)表型。此外,利用裸鼠皮下成瘤,尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移活體成像及小鼠炎癥誘導(dǎo)結(jié)直腸癌模型對以上體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。2、SRSF6識別特異性的RNA基序從而調(diào)控下游靶基因的剪接為了進(jìn)一步探討SRSF6在調(diào)控剪接中的分子機(jī)制,在結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620中穩(wěn)定敲低SRSF6,通過二代測序技術(shù)檢測轉(zhuǎn)錄組,對差異可變剪接事件進(jìn)行分析,并利用逆轉(zhuǎn)錄半定量PCR對分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。同時,在SRSF6過表達(dá)的細(xì)胞系中,通過RNA免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)將與SRSF6結(jié)合的RNA進(jìn)行分離,并使用二代測序技術(shù)檢測鑒定SRSF6結(jié)合的RNA,聯(lián)合差異可變剪接數(shù)據(jù)預(yù)測了 SRSF6的RNA結(jié)合基序。并采用凝膠遷移實(shí)驗(yàn)以及可變剪接報告基因?qū)︻A(yù)測的結(jié)合基序進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。3、SRSF6調(diào)控ZO-1可變剪接促進(jìn)腫瘤進(jìn)程作為SRSF6的下游靶基因,緊密連接蛋白ZO-1存在兩種不同的可變剪接轉(zhuǎn)錄本:23號外顯子保留的轉(zhuǎn)錄本(E23+)以及23號外顯子缺失轉(zhuǎn)錄本(E23-)。當(dāng)SRSF6敲低以后,細(xì)胞中ZO-IE23+轉(zhuǎn)錄本增加并能抑制腫瘤侵襲遷移能力,而當(dāng)增加的ZO-1 E23+轉(zhuǎn)錄本被siRNA敲低后,細(xì)胞的侵襲遷移能力又得到了恢復(fù)。為了進(jìn)一步探討ZO-1 E23+同E23-轉(zhuǎn)錄本在結(jié)直腸癌中的功能,在六種結(jié)直腸癌細(xì)胞系中檢測了兩種轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。設(shè)計(jì)特異性siRNA干擾ZO-1 E23+轉(zhuǎn)錄本以及同時干擾ZO-1整體RNA。我們發(fā)現(xiàn),當(dāng)ZO-1E23+被干擾后,細(xì)胞的侵襲遷移能力明顯上升,而ZO-1E23-不影響細(xì)胞侵襲遷移能力。同時,在裸鼠皮下成瘤以及炎癥誘導(dǎo)結(jié)直腸癌小鼠模型中,發(fā)現(xiàn)SRSF6表達(dá)與ZO-1第23號外顯子剪接呈正相關(guān),并且在311對結(jié)直腸正常腫瘤配對組織樣本中對以上結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。重要的是,通過臨床樣本中ZO-1的剪接情況分析,發(fā)現(xiàn)ZO-1第23號外顯子的保留往往預(yù)示著更好的臨床預(yù)后結(jié)果。4、茚達(dá)特羅通過阻斷SRSF6的功能抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)程為了探討SRSF6在結(jié)直腸癌中發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域,在SRSF6敲低的細(xì)胞中,過表達(dá)不同的SRSF6截?cái)嗟鞍?發(fā)現(xiàn)RRM2結(jié)構(gòu)域在SRSF6介導(dǎo)的侵襲遷移作用中發(fā)揮重要的作用,并且通過凝膠遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RRM2結(jié)構(gòu)域與SRSF6特異的RNA結(jié)合基序具有較好的親和性。由于SRSF6蛋白晶體結(jié)構(gòu)尚未見報道,通過計(jì)算機(jī)同源模建模擬SRSF6蛋白結(jié)構(gòu),并且針對RRM2結(jié)構(gòu)域潛在RNA結(jié)合口袋,在4855個FDA批準(zhǔn)藥物中進(jìn)行篩選潛在的SRSF6抑制劑,虛擬篩選發(fā)現(xiàn)作為慢性阻塞性肺病的長效藥茚達(dá)特羅可能具有阻斷SRSF6的作用。在體外實(shí)驗(yàn)中,通過逆轉(zhuǎn)錄PCR對茚達(dá)特羅處理的細(xì)胞中可變剪接事件進(jìn)行分析,確認(rèn)了茚達(dá)特羅具有拮抗SRSF6的剪接調(diào)控作用,并通過體外實(shí)驗(yàn)檢測茚達(dá)特羅對結(jié)直腸癌的抑制作用;在炎癥誘導(dǎo)小鼠結(jié)直腸癌模型中,我發(fā)現(xiàn)低劑量茚達(dá)特羅組小鼠腫瘤灶相對于對照組明顯減少,高劑量茚達(dá)特羅能夠完全抑制結(jié)直腸癌�；谝陨蠈�(shí)驗(yàn)結(jié)果,得出了以下結(jié)論:(1)結(jié)直腸癌中異常高表達(dá)的剪接因子SRSF6能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖與遷移作用,并且高表達(dá)SRSF6預(yù)示著較差的病人預(yù)后,可以作為結(jié)直腸癌組織的一個獨(dú)立標(biāo)志物;(2)SRSF6能夠調(diào)控大量的RNA剪接,通過結(jié)合到ZO-1前體RNA第23號外顯子,SRSF6能夠促進(jìn)第23號外顯子的剪接從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移,在腫瘤樣本中,第23號外顯子的保留伴隨著更好的病人預(yù)后,因此ZO-1的可變剪接可以作為結(jié)直腸癌組織的一個獨(dú)立標(biāo)志物;(3)根據(jù)“老藥新用”的思想,發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病藥物茚達(dá)特羅能夠阻斷SRSF6的剪接調(diào)控功能,并且在體內(nèi)體外模型中對結(jié)直腸癌具有抑制作用,可以作為一種潛在的結(jié)直腸癌臨床治療藥物。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.34
【部分圖文】：

主要的ＬＢ瓊脂平板上，３７°Ｃ倒置培養(yǎng)１２－１６ｈ。在轉(zhuǎn)化后至１５ｍｌ含氨芐青霉素（ｌＯＯｐｇ／ｍｌ）的ＬＢ培養(yǎng)基中，６０００ｉｐｍ轉(zhuǎn)速下，在４°Ｃ離心機(jī)中進(jìn)行離心收集大糖凝膠電泳后驗(yàn)證片段大小測序。??變剪接報告基因的構(gòu)建??ＢａｍＨＩ?Ｘｂａｌ?Ｓａｉｌ?Ｘｈｏｌ?Ａｐａｌ??

論文４實(shí)驗(yàn)結(jié)果??６在結(jié)直腸癌俎織樣本中的表迗??工作中，發(fā)現(xiàn)ＬＩＮＣ０１１３３作為一個抑癌長非編碼ＲＮＡ，能夠直接結(jié)合，從而抑制其對結(jié)直腸癌ＥＭＴ的促進(jìn)作用。為了進(jìn)ＲＳＦ６在結(jié)直腸癌中的作用。首先在ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫中分析發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星低頻不穩(wěn)定結(jié)直腸癌病人中ＳＲＳＦ６基因拷貝數(shù)增加（ＣＮＶ?ｂＭｉｃｒｏＳａｔｅｌｌｉｔｅ??

圖４．１．２?ＳＲＳＦ６在不同結(jié)直腸癌分期樣本中的拷貝數(shù)??癌基因的拷貝數(shù)增加往往會導(dǎo)致癌基因表達(dá)上升，為了探討ＳＲＳＦ６是否會導(dǎo)致其表達(dá)量的上調(diào)，首先對ＳＲＳＦ６ｍＲＮＡ水關(guān)系進(jìn)行了回歸分析，如圖４．１．３所示，在３１７例結(jié)直腸癌樣本中平與其基因拷貝數(shù)呈正相關(guān)聯(lián)系，說明拷貝數(shù)的增加會上調(diào)Ｓ的表達(dá)量。??Ｓ?－?＊??�。螅海海海埃�，??
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1 萬樂棟;SRSF6促進(jìn)結(jié)直腸癌惡性進(jìn)展的機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2018年

本文編號：2881127