目的:探究STAT3在ras癌基因誘導(dǎo)的肝腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制。方法:1.提取9月齡H-ras12V轉(zhuǎn)基因雄鼠肝腫瘤組織(T)、腫瘤周圍組織(P)以及9月齡非轉(zhuǎn)基因雄鼠肝組織(Wt)樣本,經(jīng)病理確認(rèn)后,提取總蛋白質(zhì)和總RNA;提取人正常肝細(xì)胞株L-O2和人肝癌細(xì)胞株Hep3B的總蛋白質(zhì)和總RNA;應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測組織和細(xì)胞樣本中p-ERK、ERK、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、m TOR、p-STAT3、STAT3的蛋白水平;熒光定量PCR檢測STAT3下游靶基因pik3r1在組織和細(xì)胞樣本中的mRNA表達水平。2.用抑制劑LY294002、PD184352和Rapamycin(RAPA)分別抑制Hep3B細(xì)胞的PI3K/AKT、ERK和mTOR信號通路活性,在抑制后3,6和12 h提取總蛋白質(zhì),檢測抑制劑對STAT3蛋白及其磷酸化水平的影響,在抑制后6,12和18 h提取總RNA,檢測抑制劑對STAT3的下游靶基因pik3r1 mRNA水平的影響。結(jié)果:1.p-ERK的蛋白水平檢測表明:T組織中的p-ERK蛋白水平為22.09±6.57,與Wt組織的0.08±0.02相比顯著升高(t=5.80,P=0.004),與P組織的8.60±3.23相比也顯著升高(t=3.19,P=0.033),P組織比Wt組織顯著升高(t=4.57,P=0.045);細(xì)胞水平檢測結(jié)果顯示,人肝癌細(xì)胞系Hep3B中的p-ERK水平為人正常肝細(xì)胞系L-O2的10.87倍。ERK的蛋白水平檢測表明:T組織中的ERK蛋白水平為16.39±3.40,與Wt組織的5.27±1.43相比顯著升高(t=4.20,P=0.025),與P組織的4.76±1.79相比也顯著升高(t=5.24,P=0.006);細(xì)胞水平檢測結(jié)果顯示,人肝癌細(xì)胞系hep3b中的erk水平為人正常肝細(xì)胞系l-o2的24.77倍。p-pi3k的蛋白水平檢測結(jié)果表明:t組織中的p-pi3k蛋白水平為0.45±0.04,與wt組織的0.06±0.00相比顯著升高(t=8.12,p=0.004),與p組織的0.23±0.04相比也顯著升高(t=4.12,p=0.015),p組織比wt組織顯著升高(t=3.32,p=0.045);細(xì)胞水平檢測結(jié)果顯示,p-pi3k水平在人正常肝細(xì)胞系l-o2和人肝癌細(xì)胞系hep3b中沒有顯著差異。pi3k的蛋白水平檢測結(jié)果表明:t組織中的pi3k蛋白水平為0.87±0.13,與wt組織的0.03±0.00相比顯著升高(t=10.56,p0.001),與p組織的0.28±0.09相比也顯著升高(t=3.96,p=0.029),p組織比wt組織顯著升高(t=3.43,p=0.019);細(xì)胞水平檢測結(jié)果顯示,人正常肝細(xì)胞系l-o2中的pi3k水平為人肝癌細(xì)胞系hep3b的500倍。p-akt的蛋白水平檢測結(jié)果表明:t組織中的p-akt蛋白水平為0.69±0.04,與wt組織的0.10±0.02相比顯著升高(t=22.90,p0.001),與p組織的0.08±0.03相比也顯著升高(t=21.58,p0.001);細(xì)胞水平檢測結(jié)果顯示,人肝癌細(xì)胞系hep3b中的p-akt水平為人正常肝細(xì)胞系l-o2的6.77倍。akt的蛋白水平檢測結(jié)果表明:t組織中的akt蛋白水平為0.19±0.04,與wt組織的0.08±0.05相比顯著升高(t=2.96,p=0.041),p組織中的akt蛋白水平為0.25±0.04,與wt組織的相比也顯著升高(t=4.38,p=0.012);細(xì)胞水平檢測結(jié)果顯示,人肝癌細(xì)胞系hep3b中的akt水平為人正常肝細(xì)胞系l-o2的6.75倍。p-mtor的蛋白水平檢測結(jié)果表明:t組織中的p-mtor蛋白水平為0.44±0.02,與wt組織的0.14±0.03相比顯著升高(t=14.36,p0.001),與p組織的0.16±0.04相比也顯著升高(t=10.51,p0.001);細(xì)胞水平檢測結(jié)果顯示,人肝癌細(xì)胞系hep3b中的p-mtor水平為人正常肝細(xì)胞系l-o2的21.74倍。mtor的蛋白水平檢測結(jié)果表明:mtor的表達水平在wt(0.18±0.06)、p(0.35±0.27)和t(0.61±0.67)之間沒有顯著差異;細(xì)胞水平檢測結(jié)果顯示,人正常肝細(xì)胞系l-o2中的mtor水平為人肝癌細(xì)胞系hep3b的5倍。p-stat3的蛋白水平檢測結(jié)果表明:wt組織中的p-stat3蛋白水平為42.87±9.36,與t組織的4.27±0.72相比顯著升高(t=4.119,p=0.015),p組織中的p-stat3蛋白水平為32.47±3.21,與t組織的相比也顯著升高(t=8.73,p=0.001);細(xì)胞水平檢測結(jié)果顯示,人正常肝細(xì)胞系l-o2中的p-stat3水平為人肝癌細(xì)胞系hep3b的10倍。stat3的蛋白水平檢測結(jié)果表明:wt(25.81±8.97)、p(27.81±0.61)和t(26.67±0.43)中STAT3的水平?jīng)]有顯著差異;細(xì)胞水平檢測結(jié)果顯示,人正常肝細(xì)胞系L-O2中的STAT3水平為人肝癌細(xì)胞系Hep3B的2倍。熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,與Wt相比,STAT3的靶基因pik3r1 mRNA水平在P、T中顯著降低(P0.01);細(xì)胞水平檢測結(jié)果顯示,同L-O2相比,pik3r1 mRNA水平在Hep3B中顯著降低(P0.001)。2.抑制實驗結(jié)果顯示:應(yīng)用LY294002抑制劑后,與對照組相比,隨著抑制時間的延長,p-AKT的水平逐漸降低,表明AKT的活化水平被有效抑制,與AKT的活化水平降低相反,p-STAT3水平明顯升高;應(yīng)用PD184352抑制劑后,與對照組相比,p-ERK水平幾乎檢測不到,表明ERK的活化水平被有效抑制,與ERK的活化水平降低相一致,p-STAT3水平也明顯降低;應(yīng)用RAPA抑制劑后,與對照組相比,在3 h,p-mTOR水平明顯升高,與之相反,p-STAT3水平明顯降低,在6 h,二者均沒有顯著變化,在12 h,p-mTOR水平明顯降低,與之相反,p-STAT3水平明顯升高。應(yīng)用LY294002和PD184352抑制劑后,同正常對照組相比,pik3r1mRNA水平在6 h,12 h明顯升高,在18 h又恢復(fù)到正常水平。應(yīng)用RAPA抑制劑后,同正常對照組相比,pik3r1 mRNA水平在6 h沒有明顯變化,在12和18 h明顯升高。結(jié)論:體內(nèi)檢測結(jié)果表明,在肝腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中,ras信號通路的激活直接誘導(dǎo)了p-STAT3及其下游靶基因pik3r1 mRNA水平的降低,提示STAT3可能具有抑制肝腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。體外檢測結(jié)果也顯示STAT3可能具有抑制人肝癌細(xì)胞株Hep3B的作用。抑制實驗的結(jié)果表明,在Hep3B細(xì)胞中,ERK通路的活化能激活STAT3;而PI3K/AKT及mTOR通路對STAT3的活性可能起到抑制作用。
【學(xué)位單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R735.7
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
前言
材料和方法
    1 材料
    2 方法
結(jié)果
    1.病理分析
    2.ERK蛋白的表達水平及磷酸化水平的變化
    3.PI3K蛋白表達水平及磷酸化水平的變化
    4.AKT蛋白表達水平及磷酸化水平的變化
    5.mTOR蛋白表達水平及磷酸化水平的變化
    6.STAT3蛋白表達水平及磷酸化水平的變化
    7.STAT3下游靶基因pik3r1 mRNA水平的變化
    8.體外細(xì)胞系中ERK蛋白表達水平及磷酸化水平的變化
    9.體外細(xì)胞系中PI3K蛋白表達水平及磷酸化水平的變化
    10.體外細(xì)胞系中AKT蛋白表達水平及磷酸化水平的變化
    11.體外細(xì)胞系中mTOR蛋白表達水平及磷酸化水平的變化
    12.體外細(xì)胞系中STAT3蛋白表達水平及磷酸化水平的變化
    13.體外細(xì)胞系中pik3r1 mRNA水平的變化
    14.PI3K、ERK、mTOR抑制劑對STAT3水平的影響
    15.PI3K、ERK、mTOR抑制劑對pik3r1 mRNA水平的影響
討論
結(jié)論
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況
致謝

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本文編號：2879966