目的:探討miR-381在前列腺癌細(xì)胞中的作用,尋找其靶基因,為治療前列腺癌提供科學(xué)依據(jù)。方法:1.通過慢病毒轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定的PC-3、DU145細(xì)胞系,RT-PCR法檢測miR-381表達(dá)水平,MTT實(shí)驗(yàn)、克隆形成和EdU實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力,劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平;Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白(Cleaved-Caspase-3,Cleaved-Caspase-9,Bax,Bcl-2,MMP2,MMP9,E-cadherin,N-cadherin)的表達(dá)水平。2.前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3等轉(zhuǎn)染miR-381后,接種于裸鼠皮下;記錄腫瘤體積大小,檢測miR-381對成瘤能力的影響。3.利用生物學(xué)信息技術(shù)Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_72/)對miR-381靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測,利用雙熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證MAP3K2是否是miR-381的靶基因。4.qRT-PCR檢測MAP3K2過表達(dá)效率。試驗(yàn)設(shè)置為四組:未轉(zhuǎn)染組(Blank)、空載組(pcDNA 3.1-NC)、pcDNA 3.1-MAP3K2轉(zhuǎn)染組(pcDNA 3.1-MAP3K2)、pcDNA 3.1-MAP3K2和miR-381 mimics共轉(zhuǎn)組(pcDNA 3.1-MAP3K2+miR-381mimics)。同第一部分的試驗(yàn)方法,分析增殖和遷移侵襲相關(guān)數(shù)據(jù)。結(jié)果:1.熒光定量qRT-PCR提示,轉(zhuǎn)染了miR381的PC-3和DU145細(xì)胞中miR-381表達(dá)水平顯著高于對照組,表明轉(zhuǎn)染成功;MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞克隆形成、EdU實(shí)驗(yàn)顯示miR-381過表達(dá)組細(xì)胞增殖明顯減弱,劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)細(xì)胞遷移和侵襲水平也表現(xiàn)出下降趨勢;流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)表明miR-381高表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。與Blank組相比,miR-381 mimics組細(xì)胞Cleaved-Caspase-3,Cleaved-Caspase-9,Bax和E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯升高;相反的,Bcl-2,MMP-2,MMP-9和N-cadherin表達(dá)水平則顯著降低。2.過量表達(dá)miR-381能顯著抑制裸鼠移植瘤的生長,增加移植瘤中腫瘤細(xì)胞cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-3表達(dá)。3.Targetscan軟件和雙熒光素酶靶標(biāo)實(shí)驗(yàn)表明MAP3K2是miR-381中的一個靶基因,MAP3K2在前列腺癌中的表達(dá)水平隨著miR-381的升高反而降低。4.相對pcDNA 3.1-NC組,pcDNA 3.1-MAP3K2組展現(xiàn)出更高的增殖、抗凋亡和遷移侵襲能力。相對于pcDNA 3.1-MAP3K2組,pcDNA3.1-MAP3K2+miR-381 mimics組細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力下降,細(xì)胞凋亡水平提高。上述結(jié)果提示miR-381可能通過下調(diào)MAP3K2的表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞的進(jìn)展。結(jié)論:相對正常細(xì)胞,miR-381在前列腺癌細(xì)胞PC-3和DU145中低表達(dá)。過表達(dá)miR-381可顯著降低其細(xì)胞的生存能力,包括增殖、抗凋亡、遷移、侵襲和EMT。而抑制miR-381可產(chǎn)生與之相反的作用。此外,體內(nèi)試驗(yàn)跟細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致:過量表達(dá)miR-381顯著降低了裸鼠移植瘤的生長,并誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。MAP3K2是miR-381的重要靶基因,miR-381可能通過下調(diào)MAP3K2基因的表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.25
【部分圖文】：

圖 2-1 miR-381 在細(xì)胞 PC-3，DU145 和 RWPE-1 中的表達(dá)水平。**P< 0.01.2.3.2 RT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染效率提取各組細(xì)胞總 RNA，qRT-PCR 檢測細(xì)胞中 miR-381 的表達(dá)水平，如圖 2-2所示，轉(zhuǎn)染 miR-381 mimics 后，PC-3 和 DU145 細(xì)胞中 miR-381 表達(dá)量明顯高于空載對照組和空白對照組。相反的，轉(zhuǎn)染 miR-381 inhibitors 后，miR-381 表達(dá)水平明顯降低。由此證明，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)是成功的。

MTT檢測PC-3和DU145細(xì)胞生長情況

PC-3和DU145細(xì)胞克隆形成情況
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本文編號：2880241