研究目的:肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率逐年上升,現(xiàn)已成為世界范圍內第三大最常見的癌癥死亡原因。腫瘤血管生成是腫瘤生長、侵襲、轉移的重要步驟,因此抗血管治療已成為當前防治研究的熱點。血管生成擬態(tài)(Vasculogenic mimicry,VM)是一種不同于內皮依賴性血管的特殊的腫瘤血液供應模式,其存在與腫瘤的不良預后相關,但其發(fā)生的機制尚不明確。本研究采用免疫組化方法檢測了賴氨酰氧化酶樣蛋白2(LOXL2)、含有IQ模體的Ras GTP酶活化蛋白1(IQGAP1)、VM在201例HCC組織中的表達情況,分別分析LOXL2、IQGAP1與VM及臨床資料的關系,并探討LOXL2與IQGAP1的相關性。通過細胞轉染、免疫印跡等細胞實驗研究LOXL2、IQGAP1對HCC細胞遷移、侵襲、增殖及形成VM能力的影響,研究其促進HCC發(fā)生發(fā)展的機制,從而為HCC的靶向治療提供新的分子靶點。研究方法:1.本研究收集了經手術切除的肝細胞肝癌組織標本201例,以上標本均來自天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院、天津醫(yī)科大學總醫(yī)院,所取標本均經病理醫(yī)師確診。采用免疫組化和CD31/PAS雙染,檢測LOXL2、IQGAP1的表達水平和VM的存在情況。分別分析LOXL2、IQGAP1的表達與HCC臨床病理因素、VM及其與患者生存預后的關系,并分析LOXL2與IQGAP1之間的相關性。2.應用Western blot檢測LOXL2在肝癌細胞系中的本底表達,篩選出本底低表達和高表達的細胞系。采用質粒轉染的方法調節(jié)LOXL2的表達,構建并篩選出相應的穩(wěn)定轉染細胞系。運用劃痕、遷移、侵襲、三維培養(yǎng)實驗檢測LOXL2對肝癌細胞遷移、侵襲和VM形成能力的影響。Western blot鑒定轉染效率并檢測VM相關分子VE-vadherin、MMP2、MMP9的表達變化,并采用免疫熒光法驗證。3.采用質粒轉染的方法,將IQGAP1下調質粒轉入上述LOXL2上調穩(wěn)轉細胞系中;將IQGAP1上調質粒轉入上述LOXL2下調穩(wěn)轉細胞系中。劃痕、遷移、侵襲、三維培養(yǎng)、免疫印跡實驗檢測IQGAP1對于LOXL2功能恢復的影響。免疫共沉淀實驗檢測LOXL2與IQGAP1的關系。4.應用Western blot檢測IQGAP1在肝癌細胞系中的表達情況,篩選出本底低表達和高表達IQGAP1的細胞系。采用質粒轉染的方法調節(jié)IQGAP1的表達,構建轉染細胞系。運用劃痕、遷移、侵襲、三維培養(yǎng)、平板克隆、軟瓊脂克隆和MTT增殖實驗檢測IQGAP1對肝癌細胞遷移、侵襲、VM形成以及增殖能力的影響。采用Western blot法鑒定轉染效率并檢測VM相關分子VE-vadherin、MMP2、MMP9的表達變化。研究結果:1.201例HCC組織免疫組化結果顯示:LOXL2在肝癌細胞的胞質和胞核中表達,IQGAP1在肝癌細胞的胞質和胞膜中表達。LOXL2和IQGAP1在HCC組織中高表達,與腫瘤分級、轉移、VM相關,且LOXL2與IQGAP1的表達呈正相關。生存分析顯示LOXL2、IQGAP1陽性患者的預后均較差。2.在肝癌細胞系中,篩選出LOXL2高表達細胞系Bel7402和低表達細胞系Hep G2。在Bel7402中轉染LOXL2下調質粒,出現(xiàn)了IQGAP1、VE-cadherin、MMP2、MMP9的表達降低,遷移、侵襲、管道形成能力均減弱。在Hep G2中轉染LOXL2上調質粒,出現(xiàn)了IQGAP1、VE-cadherin、MMP2、MMP9的表達升高,遷移、侵襲、管道形成能力均增強。3.在Bel7402下調LOXL2細胞系中,轉染IQGAP1上調質粒,出現(xiàn)了IQGAP1、VE-cadherin、MMP2、MMP9的表達升高,遷移、侵襲、管道形成能力均增強。在Hep G2上調LOXL2細胞系中,轉染IQGAP1下調質粒,出現(xiàn)了IQGAP1、VE-cadherin、MMP2、MMP9的表達降低,遷移、侵襲、管道形成能力均減弱。Co-IP結果顯示LOXL2可以與IQGAP1相結合。LOXL2可能是通過調控IQGAP1的表達來影響肝癌細胞侵襲、遷移及VM形成的能力。4.在肝癌細胞系中,篩選出IQGAP1高表達細胞系SMMC7721和低表達細胞系Hep G2。在SMMC7721中轉染IQGAP1下調質粒,出現(xiàn)了VE-cadherin、MMP2、MMP9的表達降低,遷移、侵襲、管道形成能力均減弱。平板克隆、軟瓊脂克隆、MTT增殖實驗顯示,IQGAP1的下調抑制了SMMC7721細胞的增殖能力。在Hep G2中轉染IQGAP1上調質粒,出現(xiàn)了VE-cadherin、MMP2、MMP9的表達升高,遷移、侵襲、管道形成能力均增強。平板克隆、軟瓊脂克隆、MTT增殖實驗顯示,IQGAP1的上調增強了Hep G2細胞的增殖能力。以上結果顯示:IQGAP1在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要的角色,IQGAP1的上調可以明顯促進肝癌細胞的惡性生物學行為。5.LOXL2通過調控IQGAP1的表達來促進肝細胞肝癌血管生成擬態(tài)的形成。當LOXL2上調時出現(xiàn)了IQGAP1的高表達,LOXL2可以與更多的IQGAP1相結合,從而促進肝癌細胞的遷移侵襲能力,進而促進肝癌VM的形成。在LOXL2表達水平低的細胞系中上調IQGAP1的表達,上調的IQGAP1可以彌補LOXL2下調所引起的對遷移、侵襲、VM的抑制能力。這表明LOXL2是通過調控IQGAP1來促進肝癌細胞的惡性生物學行為,IQGAP1在肝細胞肝癌血管生成擬態(tài)的形成中起重要作用。研究結論:1.LOXL2和IQGAP1在肝癌組織中高表達,與腫瘤分級、轉移、VM形成相關,且影響患者預后。LOXL2與IQGAP1存在相關關系。2.LOXL2可以通過IQGAP1促進肝癌細胞的遷移、侵襲、管道形成能力。3.IQGAP1能增強肝癌細胞的遷移、侵襲、增殖、管道形成能力,促進其惡性生物學行為的進展。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

天津醫(yī)科大學碩士學位論文 一、LOXL2、IQGAP1 在 HCC 組織中的表達及其與 VM 的關系CD31/PAS 染色后內皮依賴性血管顯示 CD31,PAS 雙陽性；VM 顯示 CD31 陰性，PAS 陽性。圖 1.1 中紅色剪頭所指的為 VM，由腫瘤細胞圍成的管道，基底膜在周圍包圍，管腔內有紅細胞襯覆。

男 39 130女 9 23）<5 3 78≥ 5 45 75I/II 8 88III/IV 40 65無 10 110有 38 43生存分析法分析 VM 對生存的影響，我們得出M 的患者生存期更短。如圖 1.2 所示：在 201 例者的預后比無 VM 組的預后差。無 VM月，VM 組的平均生存時間 25.415±3.316 月，p<0.01）。

51.74%），97 例 LOXL2 陰性（97/201,48.26%）。根據(jù) LOXL2 染色結果，將 201 例肝癌組織標本分為 2 組，LOXL2 陽性組和 LOXL2 陰性組。圖1.3 免疫組化顯示LOXL2在HCC中的表達情況。圖a顯示LOXL2陽性表達定位于細胞核和細胞漿，圖b為LOXL2陰性表達。為了解 LOXL2 在肝癌組織中發(fā)揮的作用，我們分析了 LOXL2 與臨床病歷資料之間的關系。結果表明肝癌組織中 LOXL2 的表達與患者的年齡、性別、腫瘤大小均無關，而與腫瘤分級、轉移、VM 均相關（p<0.05）（表 1.3）。在 104例 LOXL2 陽性患者中，存在 VM 患者 32 例（32/104,30.77%）；在 97 例 LOXL2陰性患者中，存在 VM 患者 16 例（16/97,16.5%）。同時，根據(jù) KM 生存分析法，我們分析了 LOXL2 對 201 例肝癌患者生存預后情況的影響
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本文編號：2876426