發(fā)布時(shí)間：2020-11-09 12:24

　　 研究目的:肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率逐年上升,現(xiàn)已成為世界范圍內(nèi)第三大最常見的癌癥死亡原因。腫瘤血管生成是腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移的重要步驟,因此抗血管治療已成為當(dāng)前防治研究的熱點(diǎn)。血管生成擬態(tài)(Vasculogenic mimicry,VM)是一種不同于內(nèi)皮依賴性血管的特殊的腫瘤血液供應(yīng)模式,其存在與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān),但其發(fā)生的機(jī)制尚不明確。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)了賴氨酰氧化酶樣蛋白2(LOXL2)、含有IQ模體的Ras GTP酶活化蛋白1(IQGAP1)、VM在201例HCC組織中的表達(dá)情況,分別分析LOXL2、IQGAP1與VM及臨床資料的關(guān)系,并探討LOXL2與IQGAP1的相關(guān)性。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染、免疫印跡等細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究LOXL2、IQGAP1對(duì)HCC細(xì)胞遷移、侵襲、增殖及形成VM能力的影響,研究其促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,從而為HCC的靶向治療提供新的分子靶點(diǎn)。研究方法:1.本研究收集了經(jīng)手術(shù)切除的肝細(xì)胞肝癌組織標(biāo)本201例,以上標(biāo)本均來自天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院、天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院,所取標(biāo)本均經(jīng)病理醫(yī)師確診。采用免疫組化和CD31/PAS雙染,檢測(cè)LOXL2、IQGAP1的表達(dá)水平和VM的存在情況。分別分析LOXL2、IQGAP1的表達(dá)與HCC臨床病理因素、VM及其與患者生存預(yù)后的關(guān)系,并分析LOXL2與IQGAP1之間的相關(guān)性。2.應(yīng)用Western blot檢測(cè)LOXL2在肝癌細(xì)胞系中的本底表達(dá),篩選出本底低表達(dá)和高表達(dá)的細(xì)胞系。采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法調(diào)節(jié)LOXL2的表達(dá),構(gòu)建并篩選出相應(yīng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。運(yùn)用劃痕、遷移、侵襲、三維培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LOXL2對(duì)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲和VM形成能力的影響。Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效率并檢測(cè)VM相關(guān)分子VE-vadherin、MMP2、MMP9的表達(dá)變化,并采用免疫熒光法驗(yàn)證。3.采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法,將IQGAP1下調(diào)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入上述LOXL2上調(diào)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中;將IQGAP1上調(diào)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入上述LOXL2下調(diào)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中。劃痕、遷移、侵襲、三維培養(yǎng)、免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IQGAP1對(duì)于LOXL2功能恢復(fù)的影響。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LOXL2與IQGAP1的關(guān)系。4.應(yīng)用Western blot檢測(cè)IQGAP1在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況,篩選出本底低表達(dá)和高表達(dá)IQGAP1的細(xì)胞系。采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法調(diào)節(jié)IQGAP1的表達(dá),構(gòu)建轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。運(yùn)用劃痕、遷移、侵襲、三維培養(yǎng)、平板克隆、軟瓊脂克隆和MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IQGAP1對(duì)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲、VM形成以及增殖能力的影響。采用Western blot法鑒定轉(zhuǎn)染效率并檢測(cè)VM相關(guān)分子VE-vadherin、MMP2、MMP9的表達(dá)變化。研究結(jié)果:1.201例HCC組織免疫組化結(jié)果顯示:LOXL2在肝癌細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中表達(dá),IQGAP1在肝癌細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜中表達(dá)。LOXL2和IQGAP1在HCC組織中高表達(dá),與腫瘤分級(jí)、轉(zhuǎn)移、VM相關(guān),且LOXL2與IQGAP1的表達(dá)呈正相關(guān)。生存分析顯示LOXL2、IQGAP1陽性患者的預(yù)后均較差。2.在肝癌細(xì)胞系中,篩選出LOXL2高表達(dá)細(xì)胞系Bel7402和低表達(dá)細(xì)胞系Hep G2。在Bel7402中轉(zhuǎn)染LOXL2下調(diào)質(zhì)粒,出現(xiàn)了IQGAP1、VE-cadherin、MMP2、MMP9的表達(dá)降低,遷移、侵襲、管道形成能力均減弱。在Hep G2中轉(zhuǎn)染LOXL2上調(diào)質(zhì)粒,出現(xiàn)了IQGAP1、VE-cadherin、MMP2、MMP9的表達(dá)升高,遷移、侵襲、管道形成能力均增強(qiáng)。3.在Bel7402下調(diào)LOXL2細(xì)胞系中,轉(zhuǎn)染IQGAP1上調(diào)質(zhì)粒,出現(xiàn)了IQGAP1、VE-cadherin、MMP2、MMP9的表達(dá)升高,遷移、侵襲、管道形成能力均增強(qiáng)。在Hep G2上調(diào)LOXL2細(xì)胞系中,轉(zhuǎn)染IQGAP1下調(diào)質(zhì)粒,出現(xiàn)了IQGAP1、VE-cadherin、MMP2、MMP9的表達(dá)降低,遷移、侵襲、管道形成能力均減弱。Co-IP結(jié)果顯示LOXL2可以與IQGAP1相結(jié)合。LOXL2可能是通過調(diào)控IQGAP1的表達(dá)來影響肝癌細(xì)胞侵襲、遷移及VM形成的能力。4.在肝癌細(xì)胞系中,篩選出IQGAP1高表達(dá)細(xì)胞系SMMC7721和低表達(dá)細(xì)胞系Hep G2。在SMMC7721中轉(zhuǎn)染IQGAP1下調(diào)質(zhì)粒,出現(xiàn)了VE-cadherin、MMP2、MMP9的表達(dá)降低,遷移、侵襲、管道形成能力均減弱。平板克隆、軟瓊脂克隆、MTT增殖實(shí)驗(yàn)顯示,IQGAP1的下調(diào)抑制了SMMC7721細(xì)胞的增殖能力。在Hep G2中轉(zhuǎn)染IQGAP1上調(diào)質(zhì)粒,出現(xiàn)了VE-cadherin、MMP2、MMP9的表達(dá)升高,遷移、侵襲、管道形成能力均增強(qiáng)。平板克隆、軟瓊脂克隆、MTT增殖實(shí)驗(yàn)顯示,IQGAP1的上調(diào)增強(qiáng)了Hep G2細(xì)胞的增殖能力。以上結(jié)果顯示:IQGAP1在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要的角色,IQGAP1的上調(diào)可以明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。5.LOXL2通過調(diào)控IQGAP1的表達(dá)來促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌血管生成擬態(tài)的形成。當(dāng)LOXL2上調(diào)時(shí)出現(xiàn)了IQGAP1的高表達(dá),LOXL2可以與更多的IQGAP1相結(jié)合,從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移侵襲能力,進(jìn)而促進(jìn)肝癌VM的形成。在LOXL2表達(dá)水平低的細(xì)胞系中上調(diào)IQGAP1的表達(dá),上調(diào)的IQGAP1可以彌補(bǔ)LOXL2下調(diào)所引起的對(duì)遷移、侵襲、VM的抑制能力。這表明LOXL2是通過調(diào)控IQGAP1來促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,IQGAP1在肝細(xì)胞肝癌血管生成擬態(tài)的形成中起重要作用。研究結(jié)論:1.LOXL2和IQGAP1在肝癌組織中高表達(dá),與腫瘤分級(jí)、轉(zhuǎn)移、VM形成相關(guān),且影響患者預(yù)后。LOXL2與IQGAP1存在相關(guān)關(guān)系。2.LOXL2可以通過IQGAP1促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲、管道形成能力。3.IQGAP1能增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲、增殖、管道形成能力,促進(jìn)其惡性生物學(xué)行為的進(jìn)展。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 一、LOXL2、IQGAP1 在 HCC 組織中的表達(dá)及其與 VM 的關(guān)系CD31/PAS 染色后內(nèi)皮依賴性血管顯示 CD31,PAS 雙陽性；VM 顯示 CD31 陰性，PAS 陽性。圖 1.1 中紅色剪頭所指的為 VM，由腫瘤細(xì)胞圍成的管道，基底膜在周圍包圍，管腔內(nèi)有紅細(xì)胞襯覆。

男 39 130女 9 23）<5 3 78≥ 5 45 75I/II 8 88III/IV 40 65無 10 110有 38 43生存分析法分析 VM 對(duì)生存的影響，我們得出M 的患者生存期更短。如圖 1.2 所示：在 201 例者的預(yù)后比無 VM 組的預(yù)后差。無 VM月，VM 組的平均生存時(shí)間 25.415±3.316 月，p<0.01）。

51.74%），97 例 LOXL2 陰性（97/201,48.26%）。根據(jù) LOXL2 染色結(jié)果，將 201 例肝癌組織標(biāo)本分為 2 組，LOXL2 陽性組和 LOXL2 陰性組。圖1.3 免疫組化顯示LOXL2在HCC中的表達(dá)情況。圖a顯示LOXL2陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，圖b為L(zhǎng)OXL2陰性表達(dá)。為了解 LOXL2 在肝癌組織中發(fā)揮的作用，我們分析了 LOXL2 與臨床病歷資料之間的關(guān)系。結(jié)果表明肝癌組織中 LOXL2 的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小均無關(guān)，而與腫瘤分級(jí)、轉(zhuǎn)移、VM 均相關(guān)（p<0.05）（表 1.3）。在 104例 LOXL2 陽性患者中，存在 VM 患者 32 例（32/104,30.77%）；在 97 例 LOXL2陰性患者中，存在 VM 患者 16 例（16/97,16.5%）。同時(shí)，根據(jù) KM 生存分析法，我們分析了 LOXL2 對(duì) 201 例肝癌患者生存預(yù)后情況的影響
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