發(fā)布時(shí)間：2020-11-08 13:04

　　 目的:腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤,盡管腎癌治療取得了重大進(jìn)展,但預(yù)后仍然較差,死亡率仍然很高。因此,迫切需要研究腎癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,為腎癌的治療提供新的方法。課題組前期研究表明與正常腎組織相比較,VDR表達(dá)在腎癌中明顯降低,進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)TPRV5和VDR的表達(dá)水平相關(guān),提示TRPV5可能受VDR的調(diào)控參與腎細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展,然而,VDR是否調(diào)控TRPV5表達(dá),及其在腎癌生物學(xué)行為中的作及調(diào)控機(jī)制并不明確,本研究的目的為揭示VDR是否可調(diào)控TRPV5轉(zhuǎn)錄表達(dá)從而影響腎細(xì)胞癌增殖和轉(zhuǎn)移。方法:western blot和RT-PCR檢測(cè)正常腎細(xì)胞癌細(xì)胞株caki-1和786-O細(xì)胞中VDR蛋白的表達(dá)情況;用慢病毒構(gòu)建VDR過(guò)表達(dá)和敲除的caki-1和786-O細(xì)胞模型,分別用RT-PCR和western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)和敲除VDR基因的caki-1和786-O細(xì)胞的VDR的mRNA和蛋白水平變化;分別用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)和敲除VDR后,caki-1和786-O細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲情況;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)和敲除VDR后caki-1細(xì)胞的差異表達(dá)基因功能富集/信號(hào)通路分析情況;用RT-PCR和western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)和敲除VDR基因的caki-1細(xì)胞的TRPV5的mRNA和蛋白水平變化;用MTT法、Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)單純敲除VDR、同時(shí)敲除VDR和TRPV5、陰性對(duì)照組三組caki-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲情況。結(jié)果:VDR在caki-1細(xì)胞中的表達(dá)量要高于786-O細(xì)胞。體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)表過(guò)表達(dá)VDR能夠顯著抑制caki-1和786-O細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡;相反的,敲除VDR能促進(jìn)以上兩種細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并抑制細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序也表明過(guò)表達(dá)和敲除VDR的caki-1細(xì)胞顯著差異表達(dá)基因富集在細(xì)胞凋亡、增殖、分化和遷移等功能上,另外,差異表達(dá)基因顯著的富集在TGF-β、Apoptosis、TNF、Wnt等信號(hào)通路上。此外,我們發(fā)現(xiàn)TRPV5和VDR表達(dá)呈負(fù)相關(guān),即VDR敲除能夠促進(jìn)TRPV5的表達(dá),VDR過(guò)表達(dá)則抑制TRPV5的表達(dá)。最后,單獨(dú)敲除VDR、同時(shí)敲除VDR和TRPV5、陰性對(duì)照組三組caki-1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明敲除VDR可以誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng),但在caki-1細(xì)胞敲除VDR的基礎(chǔ)上,繼續(xù)敲除TRPV5后,細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力又被削弱,換言之,敲除TRPV5可以抑制caki-1細(xì)胞被VDR敲除所誘導(dǎo)的增殖、遷移和侵襲的能力。結(jié)論:VDR在腎細(xì)胞癌細(xì)胞株中起著一個(gè)腫瘤抑制因子的作用,此外,VDR可以通過(guò)調(diào)控TRPV5的轉(zhuǎn)錄表達(dá)來(lái)抑制腎癌細(xì)胞株的增殖和轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R737.11
【部分圖文】：

3.1 VDR 在不同組別腎細(xì)胞癌細(xì)胞株內(nèi)的表達(dá)情況如圖 1.1（A）所示，WB 和 RT-PCR 結(jié)果顯示 VDR 在 RCC 細(xì)胞株 caki-1 和 786-O細(xì)胞中均表達(dá)，且 VDR 在 caki-1 細(xì)胞中的表達(dá)量要高于 786-O 細(xì)胞。如圖 1.1（B）和（C）所示，WB 和 RT-PCR 結(jié)果顯示在 RCC 細(xì)胞株 caki-1 和786-O 細(xì)胞中，LeVDR 組（VDR 過(guò)表達(dá)組）較 LeCtrl 組（過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組）VDR的表達(dá)量明顯升高；而 shVDR 組（VDR 敲除組）較 shCtrl（敲除陰性對(duì)照組）VDR的表達(dá)量明顯較少，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果證實(shí)慢病毒介導(dǎo)的 VDR 過(guò)表達(dá)和敲除有效，成功的構(gòu)建了 VDR 過(guò)表達(dá)和敲除的 RCC 細(xì)胞株。3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖 1.2 VDR 抑制 RCC 細(xì)胞增殖3.3 過(guò)表達(dá) VDR 抑制 786-O 細(xì)胞遷移；敲除 VDR 促進(jìn) 786-O 細(xì)胞遷移。Transwell 小室遷移實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VDR 過(guò)表達(dá)組的 786-O 細(xì)胞遷移能力較對(duì)照組明顯減弱（p<0.01），與之相反，VDR 敲除組的786-O 細(xì)胞遷移能力較對(duì)照組有所增強(qiáng)（p<0.05）�？梢缘贸鼋Y(jié)論，VDR 可以抑制786-O 細(xì)胞的遷移能力（見(jiàn)圖 1.3）。

圖 1.3 VDR 抑制 786-O 細(xì)胞遷移能力。左圖為細(xì)胞在 100x 光鏡下圖形；右圖為200x 光鏡下 5 個(gè)視野所得統(tǒng)計(jì)圖形3.4 過(guò)表達(dá) VDR 抑制 786-O 細(xì)胞侵襲；敲除 VDR 促進(jìn) 786-O 細(xì)胞侵襲Transwell 小室侵襲實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VDR 過(guò)表達(dá)組的 786-O 細(xì)胞侵襲能力較對(duì)照組明顯減弱（p<0.01），與之相反，VDR 敲除組的786-O 細(xì)胞侵襲能力較對(duì)照組有所增強(qiáng)（p<0.05）�？梢缘贸鼋Y(jié)論，VDR 可以抑制786-O 細(xì)胞的侵襲能力（見(jiàn)圖 1.4）。
【參考文獻(xiàn)】

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1 陳文浩;楊明;張艷橋;;維生素D及其受體在胰腺癌中的研究進(jìn)展[J];中國(guó)腫瘤;2015年04期

2 鄭敏;劉強(qiáng);;維生素D及維生素D受體的研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2013年21期

3 那鍵;馬超;霍維玲;秦瑞云;吳曉東;許永;王濤;谷貴山;;新型Ca~(2+)通道TRPV5和TRPV6的研究進(jìn)展[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年03期

本文編號(hào)：2874827