目前原發(fā)性肝癌的惡性程度較高,預(yù)后差,化學(xué)藥物和放射治療對該疾病的控制效果較差。因此當(dāng)前對晚期肝癌缺少有效的治療方案。索拉非尼雖然能夠延長生存期,但僅延長約三個(gè)月的時(shí)間。近年來免疫治療在原發(fā)性肝癌的治療中起了一定作用,仍需要進(jìn)一步提高療效。在腫瘤免疫治療中,腫瘤抗原在以樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)為主的治療中起著較為重要的作用。腫瘤細(xì)胞裂解物被DC攝取后使DC成熟并具備激活腫瘤特異性的T細(xì)胞的功能已在多種實(shí)體腫瘤中被證實(shí)。然而負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的DC使肝癌的獲益并不顯著。最近的研究顯示腫瘤細(xì)胞來源的Exosomes(TEX)被認(rèn)為一種免疫原性較強(qiáng)的腫瘤抗原,它能夠被DC攝取,從而使DC成熟并且能夠活化腫瘤特異性的T細(xì)胞使其對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。在腫瘤抗原的持續(xù)刺激下,活化的CD8+T細(xì)胞表面表達(dá)一種抑制性受體(程序性死亡分子受體1,programmed death-1,PD-1),該受體與配體結(jié)合后使CD8+T細(xì)胞失去分泌細(xì)胞因子及增殖的能力,從而使活化的CD8+T細(xì)胞失去對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。研究顯示PD-1是在抗原的刺激下誘導(dǎo)性產(chǎn)生,它的產(chǎn)生需要一定的時(shí)間。雖然腫瘤細(xì)胞來源的Exosomes作為腫瘤抗原在肝癌的治療中療效優(yōu)于腫瘤細(xì)胞裂解物,但目前負(fù)載Exosomes的DC和PD-1抗體聯(lián)合應(yīng)用及應(yīng)用的最佳時(shí)間組合在肝癌中尚未被報(bào)道。本研究進(jìn)一步證實(shí)負(fù)載TEX的DC(DC-TEX)在肝癌中的抗腫瘤作用,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在給予DC-TEX后腫瘤組織內(nèi)浸潤的CD8+T細(xì)胞表達(dá)PD-1的情況,而在給予DC-TEX后不同的時(shí)間點(diǎn)給予PD-1抗體可產(chǎn)生不同的抗腫瘤作用。應(yīng)用DC-TEX及PD-1抗體可增加索拉非尼在肝癌中的療效。另外肝癌癌性腹水來源的Exosomes也可作為腫瘤抗原被DC攝取后進(jìn)一步產(chǎn)生抗腫瘤作用。最后我們對比了晚期肝癌患者和健康對照者血清中的Exosomes水平,發(fā)現(xiàn)晚期肝癌患者血清Exosomes的水平明顯升高。目的:1、進(jìn)一步證實(shí)DC-TEX在肝癌中抗腫瘤作用,同時(shí)觀察Exosomes作為腫瘤抗原是否能夠誘導(dǎo)PD-1的表達(dá)。2、明確DC-TEX聯(lián)合PD-1抗體在肝癌中能否產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用及兩者應(yīng)用的最佳時(shí)間和抗腫瘤的作用機(jī)制。3、DC-TEX聯(lián)合PD-1抗體能否增加索拉非尼對肝癌的治療作。4、晚期肝癌患者血清Exosomes的特異性蛋白是否可以作為肝癌特異性的腫瘤標(biāo)記物。5、肝癌癌性腹水來源的Exosomes能否作為腫瘤抗原及其抗腫瘤的療效和作用機(jī)制。方法:首先構(gòu)建皮下瘤模型,應(yīng)用Hepa1-6細(xì)胞構(gòu)建皮下瘤模型,待皮下瘤的長徑至1cm后,在無菌狀態(tài)下將皮下瘤取出,并將其剪碎至1mm3,然后通過穿刺針將瘤塊移植至小鼠肝左葉。并應(yīng)用小動(dòng)物MRI觀察原位瘤的生長情況。原位誘發(fā)模型應(yīng)用二乙基亞硝胺(DENA)腹腔一次性注射至15日齡C57小鼠。應(yīng)用H22細(xì)胞系構(gòu)建腹水瘤模型。應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞的變化,免疫組織化觀察腫瘤組織中PDL-1的表達(dá)。ELISA檢測外周血中細(xì)胞因子的變化。將DC與Exosomes共培養(yǎng)48小時(shí),使DC攝取Exosomes并使其成熟。DC-TEX通過尾靜脈注射,PD-1抗體采用腹腔注射的方式。CD4、CD8體內(nèi)阻斷抗體采用腹腔注射的方式,用于抗腫瘤機(jī)制的研究。晚期肝癌患者血清中的Exosomes應(yīng)用試劑盒提取,并通過Western blot檢測其特異性蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1、DC-TEX能夠?qū)Ω伟┊a(chǎn)生一定的抗腫瘤作用,但在產(chǎn)生抗腫瘤作用的同時(shí),CD8+T細(xì)胞表面的PD-1的表達(dá)也增加,在給予DC-TEX后的72小時(shí),CD8+PD-1+T細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到峰值。2、在給予DC-TEX后不同的時(shí)間點(diǎn)給予PD-1抗體,所產(chǎn)生的抗腫瘤作用不同。在應(yīng)用DC-TEX后72小時(shí)給予PD-1抗體所產(chǎn)生的抗腫瘤作用最佳。應(yīng)用CD4、CD8抗體體內(nèi)阻斷及裸鼠荷瘤模型發(fā)現(xiàn),DC-TEX及PD-1抗體的抗腫瘤作用主要通過CD8+T細(xì)胞起作用。3、DC-TEX聯(lián)合PD-1抗體可以增加索拉非尼對肝癌的治療作用。4、晚期肝癌患者血清中Exosomes的水平明顯高于健康對照,且表達(dá)一些特異性的表面蛋白。5、肝癌癌性腹水來源的Exosomes也可作為腫瘤抗原,能夠被DC攝取并且使DC成熟,且產(chǎn)生一定的抗腫瘤作用。結(jié)論:Hepa1-6細(xì)胞來源的Exosomes能夠作為腫瘤抗原被DC攝取從而誘發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)。將DC-TEX與PD-1抗體聯(lián)合應(yīng)用可產(chǎn)生不同的抗腫瘤作用。DC-TEX聯(lián)合PD-1抗體能夠增加索拉非尼的對肝癌的治療療效。另外,晚期肝癌患者的血清Exosomes水平升高。肝癌癌性腹水來源的Exosomes也可作為腫瘤相關(guān)抗原。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

圖１?Ｅｘｏｓｏｍｅｓ的特征

?北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文???細(xì)胞數(shù)量的變化及外周血中細(xì)胞因子的變化。應(yīng)用ＤＣ－ＴＥＸ治療后發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中??的ＣＤ８＋Ｔ細(xì)胞的數(shù)量在７２小時(shí)前呈逐漸增加的趨勢，而７２小時(shí)后變化不著（圖Ａ）。??這表明ＤＣ－ＴＥＸ能夠增加腫瘤組織中的ＣＤ８＋Ｔ細(xì)胞的數(shù)量，且其變化隨著時(shí)間的變??化而存在一定的差異。另外ＤＣ－ＴＥＸ在體內(nèi)活化Ｔ細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一些細(xì)胞因??子，如ＩＦＮ＿ｙ、ＩＬ－２和ＴＮＦ－ａ，這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生也預(yù)示著體內(nèi)免疫反應(yīng)的誘??發(fā)（圖Ｂ－Ｄ）。７２小時(shí)之后呈下降趨勢但其變化不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該現(xiàn)象也可以??為ＤＣ－ＴＥＸ每次治療的間隔時(shí)間的確定提供一定的參考依據(jù)。??Ａ??

圖３應(yīng)用ＤＣ－ＴＥＸ作為抗原活化Ｔ細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤組織中ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細(xì)胞數(shù)量的變化。??Ａ結(jié)果顯示，在應(yīng)用ＤＣ－ＴＥＸ后，ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細(xì)胞在０至７２小時(shí)呈逐漸増加的趨勢，９６小時(shí)或??１２０小時(shí)與７２小時(shí)比較無顯著性差異（ＺＭ３．０５）。ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細(xì)胞在７２ｈ顯著高于０、２４和４８??小時(shí)（ｎ＝６只／組，林＊代〇．?００１）。Ｂ應(yīng)用小鼠的ＩｇＧ作為ＰＤ－１的同型對照，發(fā)現(xiàn)ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ??細(xì)胞的幾乎沒有表達(dá)，并且不同時(shí)間點(diǎn)其ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細(xì)胞的變化無顯著性差異（ｎ＝６只／組，??２２??
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本文編號(hào)：2871125