目前原發(fā)性肝癌的惡性程度較高,預(yù)后差,化學藥物和放射治療對該疾病的控制效果較差。因此當前對晚期肝癌缺少有效的治療方案。索拉非尼雖然能夠延長生存期,但僅延長約三個月的時間。近年來免疫治療在原發(fā)性肝癌的治療中起了一定作用,仍需要進一步提高療效。在腫瘤免疫治療中,腫瘤抗原在以樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)為主的治療中起著較為重要的作用。腫瘤細胞裂解物被DC攝取后使DC成熟并具備激活腫瘤特異性的T細胞的功能已在多種實體腫瘤中被證實。然而負載腫瘤細胞裂解物的DC使肝癌的獲益并不顯著。最近的研究顯示腫瘤細胞來源的Exosomes(TEX)被認為一種免疫原性較強的腫瘤抗原,它能夠被DC攝取,從而使DC成熟并且能夠活化腫瘤特異性的T細胞使其對腫瘤細胞產(chǎn)生殺傷作用。在腫瘤抗原的持續(xù)刺激下,活化的CD8+T細胞表面表達一種抑制性受體(程序性死亡分子受體1,programmed death-1,PD-1),該受體與配體結(jié)合后使CD8+T細胞失去分泌細胞因子及增殖的能力,從而使活化的CD8+T細胞失去對腫瘤細胞的殺傷作用。研究顯示PD-1是在抗原的刺激下誘導性產(chǎn)生,它的產(chǎn)生需要一定的時間。雖然腫瘤細胞來源的Exosomes作為腫瘤抗原在肝癌的治療中療效優(yōu)于腫瘤細胞裂解物,但目前負載Exosomes的DC和PD-1抗體聯(lián)合應(yīng)用及應(yīng)用的最佳時間組合在肝癌中尚未被報道。本研究進一步證實負載TEX的DC(DC-TEX)在肝癌中的抗腫瘤作用,同時也發(fā)現(xiàn)在給予DC-TEX后腫瘤組織內(nèi)浸潤的CD8+T細胞表達PD-1的情況,而在給予DC-TEX后不同的時間點給予PD-1抗體可產(chǎn)生不同的抗腫瘤作用。應(yīng)用DC-TEX及PD-1抗體可增加索拉非尼在肝癌中的療效。另外肝癌癌性腹水來源的Exosomes也可作為腫瘤抗原被DC攝取后進一步產(chǎn)生抗腫瘤作用。最后我們對比了晚期肝癌患者和健康對照者血清中的Exosomes水平,發(fā)現(xiàn)晚期肝癌患者血清Exosomes的水平明顯升高。目的:1、進一步證實DC-TEX在肝癌中抗腫瘤作用,同時觀察Exosomes作為腫瘤抗原是否能夠誘導PD-1的表達。2、明確DC-TEX聯(lián)合PD-1抗體在肝癌中能否產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用及兩者應(yīng)用的最佳時間和抗腫瘤的作用機制。3、DC-TEX聯(lián)合PD-1抗體能否增加索拉非尼對肝癌的治療作。4、晚期肝癌患者血清Exosomes的特異性蛋白是否可以作為肝癌特異性的腫瘤標記物。5、肝癌癌性腹水來源的Exosomes能否作為腫瘤抗原及其抗腫瘤的療效和作用機制。方法:首先構(gòu)建皮下瘤模型,應(yīng)用Hepa1-6細胞構(gòu)建皮下瘤模型,待皮下瘤的長徑至1cm后,在無菌狀態(tài)下將皮下瘤取出,并將其剪碎至1mm3,然后通過穿刺針將瘤塊移植至小鼠肝左葉。并應(yīng)用小動物MRI觀察原位瘤的生長情況。原位誘發(fā)模型應(yīng)用二乙基亞硝胺(DENA)腹腔一次性注射至15日齡C57小鼠。應(yīng)用H22細胞系構(gòu)建腹水瘤模型。應(yīng)用流式細胞儀分析腫瘤組織中CD8+T細胞的變化,免疫組織化觀察腫瘤組織中PDL-1的表達。ELISA檢測外周血中細胞因子的變化。將DC與Exosomes共培養(yǎng)48小時,使DC攝取Exosomes并使其成熟。DC-TEX通過尾靜脈注射,PD-1抗體采用腹腔注射的方式。CD4、CD8體內(nèi)阻斷抗體采用腹腔注射的方式,用于抗腫瘤機制的研究。晚期肝癌患者血清中的Exosomes應(yīng)用試劑盒提取,并通過Western blot檢測其特異性蛋白的表達。結(jié)果:1、DC-TEX能夠?qū)Ω伟┊a(chǎn)生一定的抗腫瘤作用,但在產(chǎn)生抗腫瘤作用的同時,CD8+T細胞表面的PD-1的表達也增加,在給予DC-TEX后的72小時,CD8+PD-1+T細胞的數(shù)量達到峰值。2、在給予DC-TEX后不同的時間點給予PD-1抗體,所產(chǎn)生的抗腫瘤作用不同。在應(yīng)用DC-TEX后72小時給予PD-1抗體所產(chǎn)生的抗腫瘤作用最佳。應(yīng)用CD4、CD8抗體體內(nèi)阻斷及裸鼠荷瘤模型發(fā)現(xiàn),DC-TEX及PD-1抗體的抗腫瘤作用主要通過CD8+T細胞起作用。3、DC-TEX聯(lián)合PD-1抗體可以增加索拉非尼對肝癌的治療作用。4、晚期肝癌患者血清中Exosomes的水平明顯高于健康對照,且表達一些特異性的表面蛋白。5、肝癌癌性腹水來源的Exosomes也可作為腫瘤抗原,能夠被DC攝取并且使DC成熟,且產(chǎn)生一定的抗腫瘤作用。結(jié)論:Hepa1-6細胞來源的Exosomes能夠作為腫瘤抗原被DC攝取從而誘發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)。將DC-TEX與PD-1抗體聯(lián)合應(yīng)用可產(chǎn)生不同的抗腫瘤作用。DC-TEX聯(lián)合PD-1抗體能夠增加索拉非尼的對肝癌的治療療效。另外,晚期肝癌患者的血清Exosomes水平升高。肝癌癌性腹水來源的Exosomes也可作為腫瘤相關(guān)抗原。
【學位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

圖１?Ｅｘｏｓｏｍｅｓ的特征

?北京協(xié)和醫(yī)學院博士學位論文???細胞數(shù)量的變化及外周血中細胞因子的變化。應(yīng)用ＤＣ－ＴＥＸ治療后發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中??的ＣＤ８＋Ｔ細胞的數(shù)量在７２小時前呈逐漸增加的趨勢，而７２小時后變化不著（圖Ａ）。??這表明ＤＣ－ＴＥＸ能夠增加腫瘤組織中的ＣＤ８＋Ｔ細胞的數(shù)量，且其變化隨著時間的變??化而存在一定的差異。另外ＤＣ－ＴＥＸ在體內(nèi)活化Ｔ細胞的同時也會產(chǎn)生一些細胞因??子，如ＩＦＮ＿ｙ、ＩＬ－２和ＴＮＦ－ａ，這些細胞因子的產(chǎn)生也預(yù)示著體內(nèi)免疫反應(yīng)的誘??發(fā)（圖Ｂ－Ｄ）。７２小時之后呈下降趨勢但其變化不存在統(tǒng)計學差異。該現(xiàn)象也可以??為ＤＣ－ＴＥＸ每次治療的間隔時間的確定提供一定的參考依據(jù)。??Ａ??

圖３應(yīng)用ＤＣ－ＴＥＸ作為抗原活化Ｔ細胞，不同時間點腫瘤組織中ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞數(shù)量的變化。??Ａ結(jié)果顯示，在應(yīng)用ＤＣ－ＴＥＸ后，ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞在０至７２小時呈逐漸増加的趨勢，９６小時或??１２０小時與７２小時比較無顯著性差異（ＺＭ３．０５）。ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞在７２ｈ顯著高于０、２４和４８??小時（ｎ＝６只／組，林＊代〇．?００１）。Ｂ應(yīng)用小鼠的ＩｇＧ作為ＰＤ－１的同型對照，發(fā)現(xiàn)ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ??細胞的幾乎沒有表達，并且不同時間點其ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞的變化無顯著性差異（ｎ＝６只／組，??２２??
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本文編號：2871125