目的:腫瘤是當前世界范圍內嚴重威脅人類健康的重大疾病,轉移是引起臨床腫瘤患者死亡的主要原因。在腫瘤轉移的過程中,上皮間質轉化(EMT)起到了非常重要的作用,腫瘤細胞可通過EMT獲得間質表型,表現為具有更強的遷移、侵襲、轉移能力,從而更具惡性,更易于發(fā)生轉移。因此建立EMT研究模型對于探索腫瘤轉移機制、篩選特異性好的腫瘤轉移相關標志物具有重要意義。篩選獲得的腫瘤轉移及EMT相關標志物可用于臨床腫瘤轉移的早期判斷和有效治療。目前,研究EMT的主要策略可以分為兩類:一類是通過施加特定的影響因素誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT,包括給予TGF-β、轉染EMT轉錄因子等;另一類是從異質性腫瘤細胞中篩選獲得具有間質表型的高轉移性亞系細胞,其篩選依據是基于異質性腫瘤組織和細胞系中存在的具有不同上皮和間質表型的亞群細胞,通過對比核酸、蛋白表達等方面的差異,獲得EMT相關分子,作為判斷腫瘤轉移的重要依據,因此通過篩選亞系有助于發(fā)現新的EMT及轉移相關標志物。具有間質表型的高轉移細胞亞系可通過體內篩選法獲得:向免疫缺陷小鼠體內注射腫瘤細胞,具有更強基質降解能力的細胞可形成轉移灶,通過對轉移灶腫瘤細胞進行擴大培養(yǎng)來獲得具有間質表型的高轉移力細胞亞系,該方法能較好地重現體內復雜的腫瘤轉移環(huán)境,但是受到宿主差異的影響較大,而且費用較高、耗時較長。因此,體外篩選法日漸成為另一種重要的篩選策略,其典型代表為基于腫瘤生物學功能進行篩選的Transwell小室篩選法:通過稀釋的基質膠模擬體內基底膜微環(huán)境,在物質濃度梯度驅動下收集獲得具有更高侵襲能力、更強基質水解能力的間質表型亞系細胞,該法操作相對簡便,易于標準化,在篩選新的標志物方面具有良好的可比性,但需要較多的篩選輪次。因此,建立更加高效、簡便的腫瘤間質型高轉移亞系的篩選方法具有很大的必要性。微流控芯片是近年來興起的可將生物、化學等反應集成到一塊微米尺度芯片中自動完成的新型微全分析系統(tǒng),具有制備簡便、易于集成、模擬性強、流體操控性強等優(yōu)勢,已廣泛用于細胞分選、培養(yǎng)、侵襲、趨化、血管生成等研究中。本研究利用單泵控制濃度梯度形成的微流控芯片系統(tǒng),提供持續(xù)穩(wěn)定的濃度梯度及侵襲驅動力;通過濃度逐漸增加的基質膠提高篩選壓力和篩選效率,利用間質表型細胞的強基質降解能力和侵襲能力對其進行有效富集,建立高效獲得具有間質表型的高轉移亞系的芯片篩選系統(tǒng),為進一步篩選腫瘤轉移和EMT相關標志物提供新的思路和可行性。microRNA(miRNA)是一類存在于真核細胞內的非編碼RNA,其成熟體由18~25個核苷酸組成,通過與靶基因的3’UTR相結合而在轉錄后水平來抑制靶基因的表達,參與調節(jié)細胞增殖、分化、遷移、侵襲、轉移等多種生物學過程。目前已知多種miRNA與腫瘤EMT和轉移密切相關,但miRNA的表達及作用機制非常復雜:同一個miRNA可同時調控多個靶基因,而同一個基因也受到多個miRNA的調節(jié),因此對轉移和EMT相關miRNA的篩選和作用機制研究具有重要意義。肺癌現已成為發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,本研究擬通過建立的微流控芯片亞系篩選系統(tǒng),對異質性肺癌A549細胞進行間質表型高轉移亞系的高效篩選和鑒定,利用母系和亞系在侵襲、轉移能力等方面的差異,進行miRNA表達譜分析,以期獲得新的轉移及EMT相關miRNA,并為肺癌轉移及其調控機制的研究提供新的方案。研究方法:1.微流控芯片的制備和亞系篩選芯片系統(tǒng)的建立。(1)芯片制備。通過SU-8負光膠制備陽膜、PDMS澆注和固化、等離子封接,制備微流控芯片。(2)亞系篩選芯片系統(tǒng)的搭建。微流控芯片由泵液通道、細胞培養(yǎng)通道、基質膠通道和開放式細胞收集通道組成,通過單個微量注射泵和培養(yǎng)皿,將微流控芯片與含有不同濃度胎牛血清的培養(yǎng)基相連,可形成連續(xù)性血清濃度梯度,構建微流控芯片亞系篩選系統(tǒng)。(3)濃度梯度形成評價。利用PBS和FITC/PBS溶液,形成微流控芯片內穩(wěn)定、連續(xù)性熒光強度梯度。2.肺癌間質表型高轉移亞系的篩選和鑒定。(1)亞系篩選、收集和培養(yǎng)。利用PDMS芯片中的細胞培養(yǎng)通道,實現注入的細胞在微流控芯片中的長期培養(yǎng);通過穩(wěn)定的血清濃度梯度持續(xù)驅動細胞進行定向侵襲;利用基質膠模擬基底膜,通過逐步增加基質膠的濃度,提強篩選壓力,提高篩選效率;利用芯片中與外界相連通的開放式細胞收集通道,對侵出芯片的細胞進行消化和收集,完成細胞亞系的體外篩選和培養(yǎng)。(2)亞系形態(tài)學評價。通過相差顯微鏡比較母系和亞系細胞的形態(tài)學差異。(3)亞系體外增殖能力評價。通過MTT、軟瓊脂單克隆形成等實驗,比較分析母系、亞系細胞在體外增殖能力、單克隆形成能力、非錨定依賴性生長能力方面的差異。(4)亞系體外遷移、侵襲能力評價。通過劃痕實驗、Transwell遷移和侵襲實驗比較分析母系、亞系細胞在體外遷移、侵襲能力方面的差異。(5)亞系體內增殖、轉移能力評價。通過裸鼠皮下成瘤實驗、裸鼠轉移癌模型的建立,比較分析母系、亞系細胞在體內增殖、轉移等方面的差異。(6)亞系分子表達水平評價。通過Western blot檢測細胞中EMT相關蛋白的表達差異。3.亞系中EMT相關miRNA的篩選、鑒定和功能驗證。(1)通過miRNA表達譜芯片,篩選母系與亞系差異性表達的miRNA,并進行數據分析。(2)通過實時熒光定量PCR驗證miRNA的表達,篩選鑒定EMT相關miRNA。(3)通過MTT實驗比較miRNA mimics和inhibitor轉染后細胞體外增殖能力的差異。(4)通過Transwell遷移和侵襲實驗驗證miRNA mimics和inhibitor轉染后細胞體外遷移、侵襲能力的差異。(5)利用Miranda、MiRBase和Targetscan數據庫進行靶基因預測與數據分析。(6)通過Western blot驗證miR-200b-3p對靶基因ZEB1及下游E-cadherin表達的調控。結果:1.微流控芯片的制備及亞系篩選系統(tǒng)的建立。(1)芯片制備。制備了含有泵液通道、細胞培養(yǎng)通道、基質膠通道和開放式細胞收集通道四個不完全連接的PDMS-玻璃微流控芯片。(2)梯度形成評價。利用PBS和FITC/PBS溶液形成了從泵液通道到開放式細胞收集通道的熒光強度漸增的穩(wěn)定連續(xù)性梯度。(3)亞系篩選系統(tǒng)的建立。將注有基質膠和肺癌細胞的微流控芯片置入含有高濃度胎牛血清的培養(yǎng)基中,通過單一微量注射泵泵入含有低濃度胎牛血清的培養(yǎng)基,建立了微流控芯片亞系篩選系統(tǒng)。2.肺癌間質表型高轉移亞系的篩選和鑒定。(1)間質表型亞系的篩選及形態(tài)學變化評價。利用芯片中開放式細胞收集通道,對侵出芯片的肺癌A549細胞進行收集和擴大培養(yǎng),重復該篩選過程,并逐步提升基質膠濃度(稀釋度從2:1至1:2)以提升篩選壓力,僅經過三輪篩選即獲得了肺癌亞系A1、A2、A3細胞,各亞系細胞具有間質細胞典型的梭形細胞形態(tài)。(2)體外增殖能力評價。軟瓊脂單克隆形成實驗表明A3亞系細胞具有更強的單克隆形成能力及非錨定依賴性生長能力,符合間質表型細胞的增殖特征。(3)體外遷移和侵襲能力評價。劃痕實驗、Transwell遷移和侵襲實驗表明A3亞系較母系A549細胞具有更強的體外遷移和侵襲能力,符合間質表型細胞的特征。(4)體內增殖、轉移能力評價。裸鼠體內轉移實驗表明A3亞系細胞具有較低的增殖速度和更強的轉移能力,符合間質表型高轉移細胞的特征。(5)分子表達差異評價。Western blot結果表明A3亞系細胞中E-cadherin、ZO-1的表達顯著下調、ZEB1、fibronectin、vimentin和MMP-9的表達顯著上調,與間質表型高轉移細胞的分子表達相一致。3.EMT相關miRNA的篩選、鑒定和功能驗證。(1)EMT相關miRNA的篩選。miRNA表達譜芯片結果表明共計436個miRNA的表達存在差異(Fold change≥2),其中A3細胞較A549細胞表達上調的有259個,表達下調的有177個。(2)EMT相關miRNA的鑒定。利用實時熒光定量PCR驗證芯片檢測結果,結果顯示miR-200b-3p與miR-194-5p在A3亞系細胞中的表達顯著下調。(3)miR-200b-3p的轉染及功能驗證。將miR-200b-3p的mimics、inhibitor分別轉染A3和A549細胞,MTT實驗表明轉染后細胞的體外增殖能力無顯著差異,Transwell遷移和侵襲實驗結果表明轉染miR-200b-3p mimics后,細胞的體外遷移、侵襲能力減弱,轉染miR-200b-3p inhibitor后,細胞的遷移、侵襲能力增強。(4)miR-194-5p的轉染及功能驗證。將miR-194-5p的mimics、inhibitor分別轉染A3和A549細胞,MTT實驗表明轉染后細胞的體外增殖能力無顯著差異,Transwell遷移和侵襲實驗結果表明轉染miR-194-5p mimics后,細胞的體外遷移、侵襲能力降低,轉染miR-194-5p inhibitor后,細胞的遷移、侵襲能力增強。(5)靶基因預測與分析。利用Miranda、MiRBase和Targetscan數據庫進行miR-200b-3p和miR-194-5p等miRNA的靶基因預測和信號通路分析,預測到194條miR-200b-3p的靶基因和48條miR-194-5p的靶基因,且富集的信號通路包括Wnt、TGF-β、PI3K-Akt等EMT調節(jié)的關鍵性通路。(6)靶基因驗證。選擇miR-200b-3p的潛在靶基因ZEB1進行進一步驗證Western blot檢測顯示:轉染miR-200b-3p mimics和inhibitor后,ZEB1的表達分別發(fā)生了下調和上調,而E-cadherin的表達隨之分別上調和下調,表明miR-200b-3p通過抑制ZEB1的表達,促進E-cadherin的表達,進一步調節(jié)細胞的遷移和侵襲。結論:1.基于單泵控制的微流控芯片,建立了腫瘤間質表型高轉移亞系的芯片篩選系統(tǒng),并對肺癌A549細胞系進行了高效篩選,獲得間質表型高轉移性亞系A3細胞。通過逐級增加微流控芯片中基質膠濃度的篩選策略可高效獲得亞系,為間質表型高轉移亞系的篩選提供了新方法。2.利用獲得的亞系A3細胞,進一步篩選、獲得了與腫瘤轉移和EMT相關的miR-200b-3p和miR-194-5p,miR-200b-3p和miR-194-5p參與調節(jié)肺癌細胞的遷移和侵襲,miR-200b-3p可通過抑制靶基因ZEB1而上調E-cadherin的表達。亞系細胞中EMT調節(jié)的關鍵性信號通路Wnt、TGF-β、PI3K-AKT等得到了富集。表明本研究建立的微流控芯片亞系篩選系統(tǒng)不僅可以篩選獲得腫瘤具有間質表型的高轉移亞系,還可基于獲得的亞系細胞,進一步篩選miRNA等腫瘤轉移及EMT相關標志物,為篩選更多腫瘤轉移和EMT標志分子提供新思路和新方案。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2
【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分 ：基于微流控芯片的肺癌間質表型高轉移亞系的篩選
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 主要試劑和儀器
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
            2.1.3 試劑配制
        2.2 研究對象和分組
        2.3 實驗方法
            2.3.1 微流控芯片制作
            2.3.2 微流控芯片亞系篩選系統(tǒng)的建立與評價
            2.3.3 細胞培養(yǎng)
            2.3.4 間質表型細胞亞系的篩選
            2.3.5 間質表型細胞亞系的鑒定
            2.3.6 統(tǒng)計學分析
    3 結果
        3.1 芯片系統(tǒng)的建立與條件優(yōu)化
            3.1.1 芯片制備與微流控芯片系統(tǒng)的建立
            3.1.2 芯片系統(tǒng)條件的優(yōu)化
        3.2 肺癌間質表型細胞亞系的篩選
        3.3 肺癌間質表型高轉移細胞亞系的鑒定
            3.3.1 細胞形態(tài)變化評價
            3.3.2 體外增殖能力評價
            3.3.3 體外遷移、侵襲能力評價
            3.3.4 體內增殖、轉移能力評價
            3.3.5 分子表達差異評價
    4 討論
    5 結論
第二部分 ：亞系中EMT相關miRNA的鑒定與功能驗證
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 主要試劑和儀器
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
            2.1.3 試劑配制
        2.2 研究對象和分組
            2.3.1 細胞培養(yǎng)
            2.3.2 miRNA芯片檢測
            2.3.3 細胞轉染
            2.3.4 miRNA表達水平的檢測
            2.3.5 miRNA轉染后的細胞功能學驗證
            2.3.6 靶基因預測與驗證
            2.3.7 統(tǒng)計學分析
    3 結果
        3.1 EMT相關miRNA的篩選
        3.2 EMT相關miRNA的鑒定
        3.3 EMT相關miRNA的功能學驗證
            3.3.1 miR-200b-3p的轉染及細胞功能學驗證
            3.3.2 miR-194-5p的轉染及細胞功能學驗證
        3.4 miRNA的靶基因預測與驗證
            3.4.1 靶基因預測與分析
            3.4.2 靶基因驗證
    4 討論
    5 結論
本研究創(chuàng)新性的自我評價
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學位期間取得的研究成果
致謝
個人簡歷

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本文編號：2870554