目的:腫瘤是當(dāng)前世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病,轉(zhuǎn)移是引起臨床腫瘤患者死亡的主要原因。在腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)起到了非常重要的作用,腫瘤細(xì)胞可通過(guò)EMT獲得間質(zhì)表型,表現(xiàn)為具有更強(qiáng)的遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移能力,從而更具惡性,更易于發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此建立EMT研究模型對(duì)于探索腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制、篩選特異性好的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物具有重要意義。篩選獲得的腫瘤轉(zhuǎn)移及EMT相關(guān)標(biāo)志物可用于臨床腫瘤轉(zhuǎn)移的早期判斷和有效治療。目前,研究EMT的主要策略可以分為兩類:一類是通過(guò)施加特定的影響因素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT,包括給予TGF-β、轉(zhuǎn)染EMT轉(zhuǎn)錄因子等;另一類是從異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞中篩選獲得具有間質(zhì)表型的高轉(zhuǎn)移性亞系細(xì)胞,其篩選依據(jù)是基于異質(zhì)性腫瘤組織和細(xì)胞系中存在的具有不同上皮和間質(zhì)表型的亞群細(xì)胞,通過(guò)對(duì)比核酸、蛋白表達(dá)等方面的差異,獲得EMT相關(guān)分子,作為判斷腫瘤轉(zhuǎn)移的重要依據(jù),因此通過(guò)篩選亞系有助于發(fā)現(xiàn)新的EMT及轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物。具有間質(zhì)表型的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系可通過(guò)體內(nèi)篩選法獲得:向免疫缺陷小鼠體內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞,具有更強(qiáng)基質(zhì)降解能力的細(xì)胞可形成轉(zhuǎn)移灶,通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)來(lái)獲得具有間質(zhì)表型的高轉(zhuǎn)移力細(xì)胞亞系,該方法能較好地重現(xiàn)體內(nèi)復(fù)雜的腫瘤轉(zhuǎn)移環(huán)境,但是受到宿主差異的影響較大,而且費(fèi)用較高、耗時(shí)較長(zhǎng)。因此,體外篩選法日漸成為另一種重要的篩選策略,其典型代表為基于腫瘤生物學(xué)功能進(jìn)行篩選的Transwell小室篩選法:通過(guò)稀釋的基質(zhì)膠模擬體內(nèi)基底膜微環(huán)境,在物質(zhì)濃度梯度驅(qū)動(dòng)下收集獲得具有更高侵襲能力、更強(qiáng)基質(zhì)水解能力的間質(zhì)表型亞系細(xì)胞,該法操作相對(duì)簡(jiǎn)便,易于標(biāo)準(zhǔn)化,在篩選新的標(biāo)志物方面具有良好的可比性,但需要較多的篩選輪次。因此,建立更加高效、簡(jiǎn)便的腫瘤間質(zhì)型高轉(zhuǎn)移亞系的篩選方法具有很大的必要性。微流控芯片是近年來(lái)興起的可將生物、化學(xué)等反應(yīng)集成到一塊微米尺度芯片中自動(dòng)完成的新型微全分析系統(tǒng),具有制備簡(jiǎn)便、易于集成、模擬性強(qiáng)、流體操控性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì),已廣泛用于細(xì)胞分選、培養(yǎng)、侵襲、趨化、血管生成等研究中。本研究利用單泵控制濃度梯度形成的微流控芯片系統(tǒng),提供持續(xù)穩(wěn)定的濃度梯度及侵襲驅(qū)動(dòng)力;通過(guò)濃度逐漸增加的基質(zhì)膠提高篩選壓力和篩選效率,利用間質(zhì)表型細(xì)胞的強(qiáng)基質(zhì)降解能力和侵襲能力對(duì)其進(jìn)行有效富集,建立高效獲得具有間質(zhì)表型的高轉(zhuǎn)移亞系的芯片篩選系統(tǒng),為進(jìn)一步篩選腫瘤轉(zhuǎn)移和EMT相關(guān)標(biāo)志物提供新的思路和可行性。microRNA(miRNA)是一類存在于真核細(xì)胞內(nèi)的非編碼RNA,其成熟體由18~25個(gè)核苷酸組成,通過(guò)與靶基因的3’UTR相結(jié)合而在轉(zhuǎn)錄后水平來(lái)抑制靶基因的表達(dá),參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過(guò)程。目前已知多種miRNA與腫瘤EMT和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),但miRNA的表達(dá)及作用機(jī)制非常復(fù)雜:同一個(gè)miRNA可同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶基因,而同一個(gè)基因也受到多個(gè)miRNA的調(diào)節(jié),因此對(duì)轉(zhuǎn)移和EMT相關(guān)miRNA的篩選和作用機(jī)制研究具有重要意義。肺癌現(xiàn)已成為發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,本研究擬通過(guò)建立的微流控芯片亞系篩選系統(tǒng),對(duì)異質(zhì)性肺癌A549細(xì)胞進(jìn)行間質(zhì)表型高轉(zhuǎn)移亞系的高效篩選和鑒定,利用母系和亞系在侵襲、轉(zhuǎn)移能力等方面的差異,進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析,以期獲得新的轉(zhuǎn)移及EMT相關(guān)miRNA,并為肺癌轉(zhuǎn)移及其調(diào)控機(jī)制的研究提供新的方案。研究方法:1.微流控芯片的制備和亞系篩選芯片系統(tǒng)的建立。(1)芯片制備。通過(guò)SU-8負(fù)光膠制備陽(yáng)膜、PDMS澆注和固化、等離子封接,制備微流控芯片。(2)亞系篩選芯片系統(tǒng)的搭建。微流控芯片由泵液通道、細(xì)胞培養(yǎng)通道、基質(zhì)膠通道和開放式細(xì)胞收集通道組成,通過(guò)單個(gè)微量注射泵和培養(yǎng)皿,將微流控芯片與含有不同濃度胎牛血清的培養(yǎng)基相連,可形成連續(xù)性血清濃度梯度,構(gòu)建微流控芯片亞系篩選系統(tǒng)。(3)濃度梯度形成評(píng)價(jià)。利用PBS和FITC/PBS溶液,形成微流控芯片內(nèi)穩(wěn)定、連續(xù)性熒光強(qiáng)度梯度。2.肺癌間質(zhì)表型高轉(zhuǎn)移亞系的篩選和鑒定。(1)亞系篩選、收集和培養(yǎng)。利用PDMS芯片中的細(xì)胞培養(yǎng)通道,實(shí)現(xiàn)注入的細(xì)胞在微流控芯片中的長(zhǎng)期培養(yǎng);通過(guò)穩(wěn)定的血清濃度梯度持續(xù)驅(qū)動(dòng)細(xì)胞進(jìn)行定向侵襲;利用基質(zhì)膠模擬基底膜,通過(guò)逐步增加基質(zhì)膠的濃度,提強(qiáng)篩選壓力,提高篩選效率;利用芯片中與外界相連通的開放式細(xì)胞收集通道,對(duì)侵出芯片的細(xì)胞進(jìn)行消化和收集,完成細(xì)胞亞系的體外篩選和培養(yǎng)。(2)亞系形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)。通過(guò)相差顯微鏡比較母系和亞系細(xì)胞的形態(tài)學(xué)差異。(3)亞系體外增殖能力評(píng)價(jià)。通過(guò)MTT、軟瓊脂單克隆形成等實(shí)驗(yàn),比較分析母系、亞系細(xì)胞在體外增殖能力、單克隆形成能力、非錨定依賴性生長(zhǎng)能力方面的差異。(4)亞系體外遷移、侵襲能力評(píng)價(jià)。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)比較分析母系、亞系細(xì)胞在體外遷移、侵襲能力方面的差異。(5)亞系體內(nèi)增殖、轉(zhuǎn)移能力評(píng)價(jià)。通過(guò)裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)、裸鼠轉(zhuǎn)移癌模型的建立,比較分析母系、亞系細(xì)胞在體內(nèi)增殖、轉(zhuǎn)移等方面的差異。(6)亞系分子表達(dá)水平評(píng)價(jià)。通過(guò)Western blot檢測(cè)細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)差異。3.亞系中EMT相關(guān)miRNA的篩選、鑒定和功能驗(yàn)證。(1)通過(guò)miRNA表達(dá)譜芯片,篩選母系與亞系差異性表達(dá)的miRNA,并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。(2)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證miRNA的表達(dá),篩選鑒定EMT相關(guān)miRNA。(3)通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)比較miRNA mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染后細(xì)胞體外增殖能力的差異。(4)通過(guò)Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miRNA mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染后細(xì)胞體外遷移、侵襲能力的差異。(5)利用Miranda、MiRBase和Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)與數(shù)據(jù)分析。(6)通過(guò)Western blot驗(yàn)證miR-200b-3p對(duì)靶基因ZEB1及下游E-cadherin表達(dá)的調(diào)控。結(jié)果:1.微流控芯片的制備及亞系篩選系統(tǒng)的建立。(1)芯片制備。制備了含有泵液通道、細(xì)胞培養(yǎng)通道、基質(zhì)膠通道和開放式細(xì)胞收集通道四個(gè)不完全連接的PDMS-玻璃微流控芯片。(2)梯度形成評(píng)價(jià)。利用PBS和FITC/PBS溶液形成了從泵液通道到開放式細(xì)胞收集通道的熒光強(qiáng)度漸增的穩(wěn)定連續(xù)性梯度。(3)亞系篩選系統(tǒng)的建立。將注有基質(zhì)膠和肺癌細(xì)胞的微流控芯片置入含有高濃度胎牛血清的培養(yǎng)基中,通過(guò)單一微量注射泵泵入含有低濃度胎牛血清的培養(yǎng)基,建立了微流控芯片亞系篩選系統(tǒng)。2.肺癌間質(zhì)表型高轉(zhuǎn)移亞系的篩選和鑒定。(1)間質(zhì)表型亞系的篩選及形態(tài)學(xué)變化評(píng)價(jià)。利用芯片中開放式細(xì)胞收集通道,對(duì)侵出芯片的肺癌A549細(xì)胞進(jìn)行收集和擴(kuò)大培養(yǎng),重復(fù)該篩選過(guò)程,并逐步提升基質(zhì)膠濃度(稀釋度從2:1至1:2)以提升篩選壓力,僅經(jīng)過(guò)三輪篩選即獲得了肺癌亞系A(chǔ)1、A2、A3細(xì)胞,各亞系細(xì)胞具有間質(zhì)細(xì)胞典型的梭形細(xì)胞形態(tài)。(2)體外增殖能力評(píng)價(jià)。軟瓊脂單克隆形成實(shí)驗(yàn)表明A3亞系細(xì)胞具有更強(qiáng)的單克隆形成能力及非錨定依賴性生長(zhǎng)能力,符合間質(zhì)表型細(xì)胞的增殖特征。(3)體外遷移和侵襲能力評(píng)價(jià)。劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)表明A3亞系較母系A(chǔ)549細(xì)胞具有更強(qiáng)的體外遷移和侵襲能力,符合間質(zhì)表型細(xì)胞的特征。(4)體內(nèi)增殖、轉(zhuǎn)移能力評(píng)價(jià)。裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)表明A3亞系細(xì)胞具有較低的增殖速度和更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力,符合間質(zhì)表型高轉(zhuǎn)移細(xì)胞的特征。(5)分子表達(dá)差異評(píng)價(jià)。Western blot結(jié)果表明A3亞系細(xì)胞中E-cadherin、ZO-1的表達(dá)顯著下調(diào)、ZEB1、fibronectin、vimentin和MMP-9的表達(dá)顯著上調(diào),與間質(zhì)表型高轉(zhuǎn)移細(xì)胞的分子表達(dá)相一致。3.EMT相關(guān)miRNA的篩選、鑒定和功能驗(yàn)證。(1)EMT相關(guān)miRNA的篩選。miRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果表明共計(jì)436個(gè)miRNA的表達(dá)存在差異(Fold change≥2),其中A3細(xì)胞較A549細(xì)胞表達(dá)上調(diào)的有259個(gè),表達(dá)下調(diào)的有177個(gè)。(2)EMT相關(guān)miRNA的鑒定。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果,結(jié)果顯示miR-200b-3p與miR-194-5p在A3亞系細(xì)胞中的表達(dá)顯著下調(diào)。(3)miR-200b-3p的轉(zhuǎn)染及功能驗(yàn)證。將miR-200b-3p的mimics、inhibitor分別轉(zhuǎn)染A3和A549細(xì)胞,MTT實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的體外增殖能力無(wú)顯著差異,Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-200b-3p mimics后,細(xì)胞的體外遷移、侵襲能力減弱,轉(zhuǎn)染miR-200b-3p inhibitor后,細(xì)胞的遷移、侵襲能力增強(qiáng)。(4)miR-194-5p的轉(zhuǎn)染及功能驗(yàn)證。將miR-194-5p的mimics、inhibitor分別轉(zhuǎn)染A3和A549細(xì)胞,MTT實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的體外增殖能力無(wú)顯著差異,Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-194-5p mimics后,細(xì)胞的體外遷移、侵襲能力降低,轉(zhuǎn)染miR-194-5p inhibitor后,細(xì)胞的遷移、侵襲能力增強(qiáng)。(5)靶基因預(yù)測(cè)與分析。利用Miranda、MiRBase和Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行miR-200b-3p和miR-194-5p等miRNA的靶基因預(yù)測(cè)和信號(hào)通路分析,預(yù)測(cè)到194條miR-200b-3p的靶基因和48條miR-194-5p的靶基因,且富集的信號(hào)通路包括Wnt、TGF-β、PI3K-Akt等EMT調(diào)節(jié)的關(guān)鍵性通路。(6)靶基因驗(yàn)證。選擇miR-200b-3p的潛在靶基因ZEB1進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證Western blot檢測(cè)顯示:轉(zhuǎn)染miR-200b-3p mimics和inhibitor后,ZEB1的表達(dá)分別發(fā)生了下調(diào)和上調(diào),而E-cadherin的表達(dá)隨之分別上調(diào)和下調(diào),表明miR-200b-3p通過(guò)抑制ZEB1的表達(dá),促進(jìn)E-cadherin的表達(dá),進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和侵襲。結(jié)論:1.基于單泵控制的微流控芯片,建立了腫瘤間質(zhì)表型高轉(zhuǎn)移亞系的芯片篩選系統(tǒng),并對(duì)肺癌A549細(xì)胞系進(jìn)行了高效篩選,獲得間質(zhì)表型高轉(zhuǎn)移性亞系A(chǔ)3細(xì)胞。通過(guò)逐級(jí)增加微流控芯片中基質(zhì)膠濃度的篩選策略可高效獲得亞系,為間質(zhì)表型高轉(zhuǎn)移亞系的篩選提供了新方法。2.利用獲得的亞系A(chǔ)3細(xì)胞,進(jìn)一步篩選、獲得了與腫瘤轉(zhuǎn)移和EMT相關(guān)的miR-200b-3p和miR-194-5p,miR-200b-3p和miR-194-5p參與調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲,miR-200b-3p可通過(guò)抑制靶基因ZEB1而上調(diào)E-cadherin的表達(dá)。亞系細(xì)胞中EMT調(diào)節(jié)的關(guān)鍵性信號(hào)通路Wnt、TGF-β、PI3K-AKT等得到了富集。表明本研究建立的微流控芯片亞系篩選系統(tǒng)不僅可以篩選獲得腫瘤具有間質(zhì)表型的高轉(zhuǎn)移亞系,還可基于獲得的亞系細(xì)胞,進(jìn)一步篩選miRNA等腫瘤轉(zhuǎn)移及EMT相關(guān)標(biāo)志物,為篩選更多腫瘤轉(zhuǎn)移和EMT標(biāo)志分子提供新思路和新方案。
【學(xué)位單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2
【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語(yǔ)
第一部分 ：基于微流控芯片的肺癌間質(zhì)表型高轉(zhuǎn)移亞系的篩選
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 主要試劑和儀器
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
            2.1.3 試劑配制
        2.2 研究對(duì)象和分組
        2.3 實(shí)驗(yàn)方法
            2.3.1 微流控芯片制作
            2.3.2 微流控芯片亞系篩選系統(tǒng)的建立與評(píng)價(jià)
            2.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.3.4 間質(zhì)表型細(xì)胞亞系的篩選
            2.3.5 間質(zhì)表型細(xì)胞亞系的鑒定
            2.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 芯片系統(tǒng)的建立與條件優(yōu)化
            3.1.1 芯片制備與微流控芯片系統(tǒng)的建立
            3.1.2 芯片系統(tǒng)條件的優(yōu)化
        3.2 肺癌間質(zhì)表型細(xì)胞亞系的篩選
        3.3 肺癌間質(zhì)表型高轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系的鑒定
            3.3.1 細(xì)胞形態(tài)變化評(píng)價(jià)
            3.3.2 體外增殖能力評(píng)價(jià)
            3.3.3 體外遷移、侵襲能力評(píng)價(jià)
            3.3.4 體內(nèi)增殖、轉(zhuǎn)移能力評(píng)價(jià)
            3.3.5 分子表達(dá)差異評(píng)價(jià)
    4 討論
    5 結(jié)論
第二部分 ：亞系中EMT相關(guān)miRNA的鑒定與功能驗(yàn)證
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 主要試劑和儀器
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
            2.1.3 試劑配制
        2.2 研究對(duì)象和分組
            2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.3.2 miRNA芯片檢測(cè)
            2.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            2.3.4 miRNA表達(dá)水平的檢測(cè)
            2.3.5 miRNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞功能學(xué)驗(yàn)證
            2.3.6 靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證
            2.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 EMT相關(guān)miRNA的篩選
        3.2 EMT相關(guān)miRNA的鑒定
        3.3 EMT相關(guān)miRNA的功能學(xué)驗(yàn)證
            3.3.1 miR-200b-3p的轉(zhuǎn)染及細(xì)胞功能學(xué)驗(yàn)證
            3.3.2 miR-194-5p的轉(zhuǎn)染及細(xì)胞功能學(xué)驗(yàn)證
        3.4 miRNA的靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證
            3.4.1 靶基因預(yù)測(cè)與分析
            3.4.2 靶基因驗(yàn)證
    4 討論
    5 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性的自我評(píng)價(jià)
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷

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2 夏宇;食管癌細(xì)胞株高侵襲力亞系的建立及其生物學(xué)特性研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2012年

3 徐華;MTA1基因在肝癌細(xì)胞系HepG2及其異質(zhì)性亞系中的表達(dá)及意義[D];暨南大學(xué);2007年

4 杜彬;人肝癌HepG2不同轉(zhuǎn)移潛能異質(zhì)性細(xì)胞亞系的分離鑒定[D];暨南大學(xué);2003年

5 李廣秋;CD133~+單細(xì)胞源性結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞克隆亞系轉(zhuǎn)移潛能的異質(zhì)性[D];南方醫(yī)科大學(xué);2009年

6 趙偉;肺癌A549放射抗拒細(xì)胞亞系的建立及其抗拒機(jī)制的初步研究[D];華中科技大學(xué);2008年

7 于莉娜;人膠質(zhì)瘤細(xì)胞兩株亞系Mdm2與p53相關(guān)蛋白的異質(zhì)性分析[D];暨南大學(xué);2004年

8 張映林;高強(qiáng)度聚焦超聲不完全消融對(duì)體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞的影響[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

9 何利珍;PTEN基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO38及克隆亞系中表達(dá)的差異性比較[D];暨南大學(xué);2005年

10 陳艾保;高侵襲轉(zhuǎn)移Lovo細(xì)胞亞系的篩選與建立[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2000年

本文編號(hào)：2870554