本文關(guān)鍵詞：抗人CCL22以及CCL17免疫毒素的表達(dá)純化與體外功能驗證，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：利用巴斯德畢赤酵母來表達(dá)抗人的CCL22以及CCL17免疫毒素,得到它們的單價以及雙價免疫毒素,進(jìn)行體外的功能驗證以及單雙價免疫毒素功能比較。方法：本試驗利用畢赤酵母來生產(chǎn)抗人CCL22以及CCL17的單價和雙價免疫毒素,需要經(jīng)過兩步純化,第一步為鎳柱純化,第二步為離子柱純化。利用SDS-PAGE凝膠電泳檢測所得到免疫毒素分子量,最終Western Blot進(jìn)一步鑒定蛋白。得到目的蛋白后,使用NHS-Sulfo生物素對其進(jìn)行標(biāo)記,以供流式細(xì)胞儀檢測其與CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合能力；使用3H同位素標(biāo)記亮氨酸的方式檢測兩種單價免疫毒素對CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的抑制能力；使用CellTiter-Glo試劑盒偵測CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞中的ATP含量,來檢測免疫毒素對其增殖的抑制作用。結(jié)果：本試驗通過畢赤酵母成功表達(dá)了四種免疫毒素,即Anti-human CCL22單雙價免疫毒素以及Anti-human CCL17單雙價免疫毒素。這四種免疫毒素對CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞均具有粘附能力,且雙價免疫毒素的粘附能力大于單價免疫毒素；Anti-human CCL22及Anti-human CCL17的單價免疫毒素均能抑制CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)合成,且后者的抑制能力強于前者；所有免疫毒素對CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞活力均具有抑制作用,且雙價體的效力大于單價體。結(jié)論：本試驗成功表達(dá)了抗人的CCL22以及CCL17的單價及雙價共計四種免疫毒素,它們對于CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞均具有粘附及增殖抑制作用,其中雙價免疫毒素效果較為明顯,這些結(jié)果可以為日后的癌癥與腫瘤治療提供一定的理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：畢赤酵母 CCL22 CCL17 免疫毒素 腫瘤 流式細(xì)胞技術(shù)
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.51
【目錄】：

• 摘要6-7
• 文獻(xiàn)綜述7-12
• 1 C-C趨化因子受體4及其相關(guān)配體的研究進(jìn)展7-8
• 1.1 C-C趨化因子受體47
• 1.2 巨噬細(xì)胞源趨化因子7-8
• 1.3 胸腺活化調(diào)節(jié)因子8
• 2 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞8-9
• 2.1 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞簡介8-9
• 2.2 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與C-C趨化因子受體49
• 3 免疫毒素簡述9-10
• 4 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的簡述10-11
• 5 試驗設(shè)計11-12
• 前言12-13
• 試驗部分13-44
• 1 試驗材料13-17
• 1.1 細(xì)胞系13
• 1.2 主要試劑13-14
• 1.3 主要儀器與設(shè)備14-15
• 1.4 試劑配制15-17
• 1.5 數(shù)據(jù)處理軟件17
• 2 試驗方法17-25
• 2.1 Anti-human CCL22和Anti-human CCL17免疫毒素的表達(dá)17-20
• 2.1.1 目的基因的獲取17-19
• 2.1.2 目的基因向酵母感受態(tài)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化19
• 2.1.3 大批量表達(dá)19-20
• 2.2 蛋白質(zhì)分離純化20-21
• 2.2.1 第一步純化(鎳柱純化)20
• 2.2.2 第二步純化(離子柱純化)20-21
• 2.3 BCA法測蛋白質(zhì)濃度21-22
• 2.4 Anti-human CCL22及Anti-human CCL17免疫毒素體外功能試驗22-23
• 2.4.1 Anti-human CCL22免疫毒素粘附試驗22-23
• 2.4.2 Anti-human CCL17免疫毒素粘附試驗(步驟同2.4.1)23
• 2.5 CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞系的放射性同位素蛋白合成抑制試驗23-24
• 2.6 Anti-human CCL22免疫毒素對腫瘤細(xì)胞活力抑制試驗24-25
• 2.7 Anti-human CCL17免疫毒素對腫瘤細(xì)胞活力抑制試驗(步驟同2.6)25
• 3 結(jié)果與分析25-37
• 3.1 PCR結(jié)果25-26
• 3.2 重組基因的雙酶切驗證26-27
• 3.3 免疫毒素蛋白純化結(jié)果27-28
• 3.4 BCA法檢測蛋白濃度28
• 3.5 Anti-human CCL22免疫毒素黏附試驗流式細(xì)胞技術(shù)分析結(jié)果28-31
• 3.6 Anti-human CCL22免疫毒素粘附性解離常數(shù)(Kd)的計算31
• 3.7 Anti-human CCL17免疫毒素黏附試驗流式細(xì)胞技術(shù)分析結(jié)果31-34
• 3.8 Anti-human CCL17免疫毒素粘附性解離常數(shù)(Kd)的計算34
• 3.9 CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞系的放射性同位素蛋白合成抑制試驗34-35
• 3.10 Anti-human CCL22免疫毒素對腫瘤細(xì)胞活力抑制試驗35-36
• 3.11 Anti-human CCL17免疫毒素對腫瘤細(xì)胞活力抑制試驗36-37
• 4 分析和討論37-42
• 4.1 免疫毒素的表達(dá)和提純37-38
• 4.2 蛋白標(biāo)記生物素對免疫毒素的標(biāo)記38
• 4.3 免疫毒素體外功能的驗證38-42
• 4.3.1 Anti-human CCL22免疫毒素粘附試驗39-40
• 4.3.2 Anti-human CCL17免疫毒素粘附試驗40
• 4.3.3 CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞系的放射性同位素蛋白合成抑制試驗40-41
• 4.3.4 Anti-human CCL22免疫毒素對腫瘤細(xì)胞活力抑制能力試驗41
• 4.3.5 Anti-human CCL17免疫毒素對腫瘤細(xì)胞活力抑制能力試驗41-42
• 5 全文結(jié)論42-44
• 參考文獻(xiàn)44-48
• Abstract48-50
• 致謝50

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