本文關(guān)鍵詞：粒細(xì)胞樣髓源性抑制細(xì)胞自噬對小鼠Lewis肺癌移植瘤發(fā)展的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的觀察Lewis lung carcinoma(LLC)細(xì)胞株來源的細(xì)胞培養(yǎng)上清(tumor cellconditioned medium,TCCM)對粒細(xì)胞樣髓源性抑制細(xì)胞(granulocytic myeloidderived suppressor cells,G-MDSC)自噬的影響;研究腫瘤微環(huán)境下的G-MDSC自噬對其自身生存與免疫抑制功能的影響;研究G-MDSC自噬對小鼠Lewis肺癌移植瘤發(fā)展的影響。方法1.G-MDSC分離及鑒定構(gòu)建小鼠Lewi s肺癌移植瘤模型,磁珠分選脾臟G-MDSC,標(biāo)記細(xì)胞表面Ly-6G、Ly-6C和CD11b后,流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測其純度;將分離得到的細(xì)胞涂片后進(jìn)行瑞士-吉姆薩復(fù)合染液染色,觀察細(xì)胞形態(tài)。2.LLC細(xì)胞株來源的TCCM的制備Lewis細(xì)胞用含有10%NBCS(newborn calf serum)的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng),待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%的時(shí)候,用無血清的DMEM替換培養(yǎng)液,培養(yǎng)24h后,收集上清。3.TCCM抑制G-MDSC凋亡與上調(diào)ROS(Reactive oxygen species,ROS)用不同濃度的TCCM處理G-MDSC12h、24h,Annexin V/PI染色法,檢測細(xì)胞凋亡情況,DCFDA染色后FCM檢測對細(xì)胞效應(yīng)分子ROS的影響。4.TCCM促進(jìn)G-MDSC自噬的檢測磁珠分選得到的G-MDSC在含有TCCM和氯喹(Chloroquine,CQ)的10%FBS(fatal bovine serum)RPMI 1640刺激2h、4h,收集細(xì)胞,提取總蛋白,WB(western blot)檢測自噬小體形成標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ(light chain 3Ⅱ)的水平。5.自噬抑制G-MDSC凋亡的檢測磁珠分選獲得G-MDSC,在含有TCCM和3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA自噬的抑制劑)RPMI 1640中培養(yǎng)12h、24h,收集細(xì)胞,Annexin V/PI染色,FCM檢測自噬對G-MDSC生存的影響。6.自噬上調(diào)G-MDSC功能的檢測將G-MDSC在含TCCM和3-MA的RPMI 1640中培養(yǎng)。培養(yǎng)12h,收集細(xì)胞,與小鼠脾臟CD4~+T細(xì)胞共培養(yǎng),培養(yǎng)體系中加入抗CD3/CD28抗體,形成CD4~+T細(xì)胞增殖體系,通過3H-胸腺嘧啶核苷([3H]-thymidine,3H-Td R)摻入法檢測CD4~+T細(xì)胞增殖情況。培養(yǎng)12h、24h,收集細(xì)胞,DCFDA染色后FCM檢測ROS的表達(dá);提取總蛋白檢測精氨酸酶(arginase 1,ARG1)活性。7.G-MDSC自噬對小鼠Lewis肺癌移植瘤發(fā)展的影響構(gòu)建小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,分別在16、23d,尾靜脈注射3-MA阻斷自噬的G-MDSC,觀察小鼠移植瘤生長情況,FCM檢測分泌IFN-γ的輔助性T細(xì)胞1型(helper T cell type 1,Th1)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞1型(cytotoxic T lymphocytes type 1,Tc1)的比例。結(jié)果1.在體外,將不同濃度的TCCM加入到對G-MDSC培養(yǎng)體系中,FCM檢測刺激12h、24h對細(xì)胞生存與效應(yīng)分子ROS的影響。結(jié)果顯示TCCM有利于G-MDSC在體外存活,存在濃度依賴效應(yīng);TCCM上調(diào)G-MDSCs的效應(yīng)分子ROS的水平。2.將G-MDSC在含有TCCM和氯喹(Chloroquine,CQ)RPMI 1640中培養(yǎng)2h、4h,WB檢測細(xì)胞中LC3Ⅱ水平。結(jié)果顯示與對照組相比,TCCM處理2、4h上調(diào)了胞內(nèi)LC3Ⅱ水平,表明了腫瘤微環(huán)境中,G-MDSC自噬的水平會(huì)上調(diào)(P0.01)。3.選取TCCM占培養(yǎng)體系體積的1/2來研究自噬對G-MDSC的影響,用3-MA抑制自噬,體外培養(yǎng)24h,觀察抑制自噬對G-MDSC在體外存活的影響。結(jié)果顯示,與1/2TCCM組相比,1/2TCCM+3-MA組活細(xì)胞比例降低,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),表明抑制自噬,不利于G-MDSC在體外存活。4.體外檢測G-MDSC對CD4~+T細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示1/4TCCM+3-MA組與1/4TCCM組相比,在抑制了自噬后,G-MDSC對CD4~+T細(xì)胞增殖的抑制作用變?nèi)?結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。1/2TCCM+3-MA組與1/2TCCM組相比,G-MDSC抑制CD4~+T細(xì)胞增殖作用變?nèi)?結(jié)果也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。表明抑制G-MDSC自噬后減弱了其對CD4~+T細(xì)胞增殖的抑制作用。5.體外培養(yǎng)12h,提取細(xì)胞總蛋白,檢測ARG1活性結(jié)果顯示,1/2TCCM+3-MA組與1/2TCCM組相比,在抑制了自噬后,G-MDSC細(xì)胞中ARG1活性降低,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。6.體外培養(yǎng)12、24h,細(xì)胞染色后FCM檢測DCFDA平均熒光強(qiáng)度,以反映ROS活性。結(jié)果顯示,1/2TCCM+3-MA組與1/2TCCM組相比,抑制自噬后,G-MDSC細(xì)胞中ROS活性呈下降趨勢。7.造模22、24d時(shí),1/2TCCM+3-MA處理組小鼠腫瘤體積明顯小于1/2TCCM誘導(dǎo)的G-MDSC處理組,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05或P0.01);第25d時(shí),1/2TCCM+3-MA處理組小鼠腫瘤重量小于1/2TCCM誘導(dǎo)的G-MDSC處理組,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01),并且較1/2TCCM誘導(dǎo)的G-MDSC組,1/2TCCM+3-MA處理組小鼠脾臟Tc1和Th1的比例均升高,Tc1升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。這些結(jié)果表明阻斷GMDSC自噬能夠降低其免疫抑制功能,抗瘤免疫細(xì)胞的比例得到一定程度的恢復(fù)。結(jié)論1.TCCM在體外對G-MDSC具有促進(jìn)生存、增強(qiáng)自噬、上調(diào)ROS的作用。2.在體外,G-MDSC自噬能夠促進(jìn)細(xì)胞存活并且上調(diào)其對CD4~+T細(xì)胞增殖的抑制作用,也能夠上調(diào)其效應(yīng)分子ROS和ARG-1。3.G-MDSC自噬有利于小鼠Lewis肺癌移植瘤的發(fā)展,這可能與G-MDSC自噬抑制Tc1和Th1細(xì)胞有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：粒細(xì)胞樣髓源性抑制細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清 細(xì)胞自噬 輔助性T細(xì)胞1型 細(xì)胞毒性T細(xì)胞1型 精氨酸酶1 活性氧
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2;R730.43
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-15
• 第一章 緒論15-28
• 1.1 MDSC在腫瘤中的作用15-19
• 1.1.1 MDSC的起源和定義16-17
• 1.1.2 小鼠MDSC17-18
• 1.1.3 MDSC的免疫抑制功能18-19
• 1.2 細(xì)胞自噬19-24
• 1.2.1 概述20-22
• 1.2.2 自噬的生物學(xué)功能22-23
• 1.2.3 自噬與巨噬細(xì)胞23-24
• 1.3 研究目的、方法、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及意義24-28
• 1.3.1 研究目的24
• 1.3.2 研究方法24-25
• 1.3.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)25-27
• 1.3.4 本研究的意義27-28
• 第二章 TCCM對G-MDSC生存、功能及自噬的影響28-45
• 2.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料28-33
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器28
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和材料28-30
• 2.1.3 主要溶液配制30-33
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物33
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法33-38
• 2.2.1 構(gòu)建小鼠Lewis移植瘤模型33
• 2.2.2 G-MDSC制備及純度，形態(tài)鑒定33-35
• 2.2.3 腫瘤上清TCCM制備35
• 2.2.4 不同濃度TCCM影響G-MDSC凋亡的檢測35-36
• 2.2.5 不同濃度TCCM影響G-MDSC效應(yīng)分子ROS活性的檢測36
• 2.2.6 Western blot檢測TCCM對G-MDSC自噬的影響36-38
• 2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析38
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-43
• 2.3.1 免疫磁珠分選的模型小鼠脾臟G-MDSC純度鑒定38-39
• 2.3.2 G-MDSC瑞士吉姆薩染色后鏡下形態(tài)39-40
• 2.3.3 不同濃度TCCM對G-MDSC凋亡的影響40-41
• 2.3.4 不同濃度TCCM對G-MDSC ROS的影響41-42
• 2.3.5 TCCM對G-MDSC細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白含量的影響42-43
• 2.4 討論43-45
• 第三章 自噬對G-MDSC生存及功能的影響45-55
• 3.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料45-47
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器45
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和材料45-46
• 3.1.3 主要溶液配制46
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物46-47
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法47-50
• 3.2.1 構(gòu)建小鼠Lewis肺癌移植瘤模型47
• 3.2.2 G-MDSC制備及純度鑒定47
• 3.2.3 腫瘤上清TCCM制備47
• 3.2.4 自噬對G-MDSC凋亡影響的檢測47-48
• 3.2.5 自噬對G-MDSC抑制CD4~+T細(xì)胞增殖影響的檢測48-49
• 3.2.6 自噬對G-MDSC效應(yīng)分子ARG-1 活性影響的檢測49-50
• 3.2.7 自噬對G-MDSC效應(yīng)分子ROS活性影響的檢測50
• 3.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析50
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-53
• 3.3.1 自噬抑制G-MDSC凋亡50-51
• 3.3.2 自噬增強(qiáng)G-MDSC對CD4~+T細(xì)胞增殖的抑制作用51-52
• 3.3.3 自噬上調(diào)G-MDSC效應(yīng)分子ARG-1 活性52-53
• 3.3.4 自噬上調(diào)G-MDSC效應(yīng)分子ROS活性53
• 3.4 討論53-55
• 第四章G-MDSC自噬對小鼠LEWIS肺癌移植瘤發(fā)展的影響55-63
• 4.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料55-57
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器55
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和材料55-56
• 4.1.3 主要溶液配制56
• 4.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物56-57
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法57-59
• 4.2.1 構(gòu)建小鼠Lewis移植瘤模型57
• 4.2.2 G-MDSC體外處理57
• 4.2.3 G-MDSC自噬對小鼠腫瘤生長的影響57-58
• 4.2.4 G-MDSC自噬對小鼠脾臟中CD3~+CD8-IFN-γ+ T細(xì)胞和CD3~+CD8+IFN-γ+ T細(xì)胞比例的影響58
• 4.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析58-59
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果59-62
• 4.3.1 G-MDSC自噬促進(jìn)小鼠腫瘤生長59-60
• 4.3.2 G-MDSC自噬增加小鼠脾臟中CD3~+CD8-IFN-γ+T細(xì)胞和CD3~+CD8+IFN-γ+T細(xì)胞比例60-62
• 4.4 討論62-63
• 第五章 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)及展望63-64
• 5.1 結(jié)論63
• 5.2 創(chuàng)新點(diǎn)63
• 5.3 展望63-64
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 致謝70-71
• 攻讀碩士期間發(fā)表的文章71

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6 楊鍵;鄧玉杰;張曉燕;呂鵬飛;徐俊;楊穎;寧光;;脂肪細(xì)胞自噬檢測方法的建立及意義探討[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)第十六次全國學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2012年

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本文編號：287985