背景:膽管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)是威脅人類健康的重大疾病之一,發(fā)病率逐年升高,并且早期診斷困難,初次就診患者手術(shù)率低于30%;膽管癌根治術(shù)后5年內(nèi)生存率小于10%。目前,治療膽管癌的方法不是太多,膽管癌患者的總體預(yù)后很差。膽管癌高發(fā)于40歲以上的人群,男性的發(fā)病率略高于女性,膽管癌威脅著人類的生命,給家庭、社會和國家造成很大的經(jīng)濟(jì)及精神負(fù)擔(dān)。因此,尋找新的膽管癌治療方法是目前面臨的當(dāng)務(wù)之急。侵襲轉(zhuǎn)移是膽管癌致死的主要原因。上皮間葉樣轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是促進(jìn)膽管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的重要現(xiàn)象。而鋅指轉(zhuǎn)錄因子(zinc-finger transcription factor,SNAIL)是介導(dǎo)EMT發(fā)生的重要因子,SNAIL通過沉默E-Cadherin進(jìn)而直接或間接促進(jìn)EMT的發(fā)生。賴氨酰氧化酶樣蛋白-2(Lysyl oxidase–like2 protein,LOXL2)是EMT的關(guān)鍵調(diào)控因子。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)LOXL2參與了SNAIL的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,并且這種修飾可能依賴于K98和K137位點,而SUMO是最近發(fā)現(xiàn)的調(diào)控數(shù)百種核蛋白。LOXL2調(diào)控Snail的過程和機(jī)制還不清楚,基于上述研究和我們前期實驗結(jié)果,我們提出以下科學(xué)假設(shè):在膽管癌細(xì)胞中,LOXL2可能通過介導(dǎo)蘇素化正性調(diào)控SNAIL蛋白的表達(dá),并且這種調(diào)控可能與SANIL的K98及K137位點有關(guān)。目的:在膽管癌細(xì)胞株RBE和QBC939中,研究LOXL2調(diào)控SNAIL的過程及機(jī)制,有望為預(yù)防和治療膽管癌提供新的靶點,也為其他腫瘤的治療提供新思路。方法:為了研究LOXL2調(diào)控SNAIL的過程及機(jī)制,我們在膽管癌細(xì)胞株RBE和QBC939中瞬時轉(zhuǎn)染EX-LOXL2、EX-LOXL2-EX-SENP、EX-LOXL2-Si-SUMO、EX-LOXL2-MU等質(zhì)粒,然后通過免疫熒光和蛋白免疫印跡實驗驗證LOXL2對SNAIL的調(diào)控作用,通過免疫熒光、蛋白免疫印跡和免疫共沉淀實驗檢測LOXL2、SNAIL和SUMO的結(jié)合情況,再通過蛋白免疫印跡實驗檢驗LOXL2調(diào)控SNAIL的位點。結(jié)果:⑴在膽管癌細(xì)胞RBE和QBC939中,瞬時轉(zhuǎn)染EX-LOXL2質(zhì)粒,SNAIL蛋白的表達(dá)水平增高,(蛋白質(zhì)免疫共沉淀發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)染EX-LOXL2,SNAIL與SUMO結(jié)合)EX-LOXL2可能介導(dǎo)了SNAIL與SUMO結(jié)合。⑵在膽管癌細(xì)胞RBE和QBC939中,雙瞬時轉(zhuǎn)染EX-LOXL2和EX-SENP質(zhì)粒,SNAIL表達(dá)水平下降。雙瞬時轉(zhuǎn)染EX-LOXL2和Si-SUMO質(zhì)粒,SNAIL的表達(dá)水平同時下降。⑶在膽管癌細(xì)胞RBE中,雙瞬時轉(zhuǎn)染EX-LOXL2和K98/K137位點雙突變質(zhì)粒,SNAIL的表達(dá)水平下降。結(jié)論:在膽管癌細(xì)胞RBE和QBC939中,LOXL2通過介導(dǎo)蘇素化正性調(diào)控SNAIL,并且此過程與SNAIL的K98和K137位點有關(guān)。實驗結(jié)果為膽管癌的預(yù)防與治療提供了新的靶點及理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.8
【部分圖文】：

圖 1.1 實驗流程示意圖Figure 1.1 Schematic diagram of the experimental process.4.1 質(zhì)粒擴(kuò)增實驗我們以感受態(tài)與質(zhì)粒 10：1 的比例把質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌 DH5α 中，經(jīng)板、挑單克隆點搖菌和試劑盒提取擴(kuò)增質(zhì)粒（如圖 1.2）。如圖 1.3 是本實驗XL2 質(zhì)粒圖譜。

LOXL2質(zhì)粒圖譜

5圖 1.4 轉(zhuǎn)染過程Figure 1.4 Transfection ProcedureO-IP 檢測 LOXL2、SNAIL 和 SUMO 的結(jié)合情況疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP）用于檢測兩種蛋白合，以此確定某種蛋白的新結(jié)合蛋白。優(yōu)點是相互結(jié)合的蛋白是天譯后修飾的。免疫共沉淀原理如圖 1.5。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2868551