前列腺癌是前列腺上皮源性惡性腫瘤,轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是晚期前列腺癌患者主要的死亡原因。目前研究認(rèn)為,腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移受多種因素調(diào)控,其中緊密連接(tight junction,TJ)與腫瘤細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)以及侵襲等轉(zhuǎn)移表型密切相關(guān)。緊密連接蛋白CLDNs作為緊密連接的主要構(gòu)成成分,其表達(dá)異常能夠影響緊密連接結(jié)構(gòu)、功能以及相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)傳遞,在上皮來(lái)源惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用。Claudin-6作為緊密連接蛋白CLDNs家族的成員之一,對(duì)維護(hù)細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)和功能起著重要作用。我們課題組的前期研究中,發(fā)現(xiàn)claudin-6能夠明顯抑制乳腺癌,宮頸癌,結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移侵襲能力;推測(cè)claudin-6表達(dá)沉默可能在上皮來(lái)源的惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著作用。目前,關(guān)于前列腺癌細(xì)胞中claudin-6是否能夠抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲表型的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)使用分子生物學(xué)技術(shù),首次研究claudin-6對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用,為前列腺癌治療提供一定的理論支持。目的:探討過(guò)表達(dá)claudin-6對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)表型的影響。方法:通過(guò)RT-PCR和Western Blot方法檢測(cè)人前列腺癌細(xì)胞LNCAP和DU145中claudin-6基因和蛋白的表達(dá)狀況;利用攜帶claudin-6的慢病毒轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞LNCAP和DU145,經(jīng)過(guò)嘌呤霉素(puromycin;PM)篩選獲得過(guò)表達(dá)claudin-6的穩(wěn)定克隆;通過(guò)RT-PCR、Western Blot及細(xì)胞免疫熒光法鑒定慢病毒轉(zhuǎn)染效率以及穩(wěn)定細(xì)胞克隆中claudin-6蛋白的表達(dá)和定位;利用CCK-8試劑盒檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞的增殖能力并繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)claudin-6后前列腺癌細(xì)胞周期的分布情況;通過(guò)跨上皮電阻實(shí)驗(yàn)檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞LNCAP和DU145的跨上皮電阻;通過(guò)倒置顯微鏡觀察過(guò)表達(dá)claudin-6后前列腺癌細(xì)胞形態(tài)的改變;通過(guò)鬼筆環(huán)肽熒光染色法觀察過(guò)表達(dá)claudin-6后前列腺癌細(xì)胞骨架的改變;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)claudin-6后前列腺癌細(xì)胞的遷移侵襲能力;Western Blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)claudin-6后,EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示,前列腺癌細(xì)胞LNCAP和DU145中claudin-6低表達(dá);慢病毒轉(zhuǎn)染后獲得過(guò)表達(dá)claudin-6的穩(wěn)定克隆LNCAP和DU145;RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)claudin-6組的RNA以及蛋白水平表達(dá)均明顯高于空載組;細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染目的基因組中claudin-6均有表達(dá),并且主要表達(dá)于細(xì)胞膜上,而空載組未見(jiàn)明顯表達(dá);CCK-8細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空載組相比,過(guò)表達(dá)claudin-6組細(xì)胞的增殖能力均有下降;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)claudin-6組細(xì)胞增殖活性與空載組相比均有減弱;通過(guò)跨上皮電阻實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)claudin-6組單層細(xì)胞間跨上皮電阻明顯高于空載組;倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)claudin-6后,前列腺癌細(xì)胞形態(tài)向上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變,呈多角形,胞體扁平,界限不清;通過(guò)鬼筆環(huán)肽熒光染色法觀察過(guò)表達(dá)claudin-6后前列腺癌細(xì)胞骨架Factin熒光強(qiáng)度減弱,胞質(zhì)中微絲結(jié)構(gòu)不明顯;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染目的基因組的遷移能力與空載組相比明顯降低;Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)claudin-6組的侵襲能力與空載組相比明顯降低;Western Blot結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)claudin-6后上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)顯著上調(diào),而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論:過(guò)表達(dá)claudin-6抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力及逆轉(zhuǎn)EMT,增加前列腺癌細(xì)胞的緊密連接功能。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R737.25
【部分圖文】：

第三章 結(jié)果第三章 結(jié)果3.1 檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞系中 Claudin-6 表達(dá)水平采用 RT-PCR 技術(shù)和 Western-Blot 技術(shù)檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞系 LNCAP 和DU145 中 Claudin-6 的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在前列腺癌細(xì)胞中，Claudin-6的 mRNA 水平和蛋白水平表達(dá)較低。如圖 3.1 所示。

圖 3.2 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的 293T 細(xì)胞293T/Vector 是轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組，293T/Claudin-6 是轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒組病毒轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞 LNCAP 和 DU145后的 Cllaudin-6 慢病毒與促轉(zhuǎn)染試劑 Polybrene 分別共轉(zhuǎn)染前列腺CAP 和 DU145，傳代擴(kuò)增培養(yǎng) 15 天（加入嘌呤霉素篩選），熒光鏡轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，分別采集熒光圖像數(shù)據(jù)，如圖 3.3 所示，LNCAP 細(xì)胞基因組轉(zhuǎn)染陽(yáng)性率達(dá) 95%以上，DU145 細(xì)胞空載組和目的基因組 80%以上。

圖 3.3 熒光顯微鏡觀察慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞A：慢病毒轉(zhuǎn)染后的 LNCAP 細(xì)胞的空載組與目的基因組；B：慢病毒轉(zhuǎn)染后的 DU145 細(xì)胞的空載組與目的基因組。.3 鑒定轉(zhuǎn)染后前列腺癌細(xì)胞中 Claudin-6 的表達(dá)水平攜帶 Claudin-6 的慢病毒轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞 LNCAP 和 DU145，嘌呤霉選 15 天后，通過(guò) RT-PCR 法和 Western-Blot 法鑒定 Claudin-6 的表達(dá)水顯示，相較于空載組，目的基因組中 Claudin-6 的 mRNA 和蛋白表達(dá)水調(diào)（如圖 3.4 所示， P<0.05）。表明成功建立了兩株穩(wěn)定表達(dá) Claudin-6癌細(xì)胞系。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 韓蘇軍;張思維;陳萬(wàn)青;李長(zhǎng)嶺;;中國(guó)前列腺癌發(fā)病現(xiàn)狀和流行趨勢(shì)分析[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2013年04期

本文編號(hào)：2866115