全世界范圍內(nèi),惡性腫瘤是常見疾病。其中食管癌的發(fā)病率在全部惡性腫瘤中排名第8位,死亡率排名第6位。食管癌根據(jù)組織類型可以分為食管鱗癌和食管腺癌,其中食管鱗癌在全球范圍是最常見的食管癌組織類型,尤其在高發(fā)的東亞和非洲東南部,其中一些高危地區(qū),包括中國,大約90%的病人是食管鱗癌。根據(jù)全球最新數(shù)據(jù)估計(jì),每年全球范圍內(nèi)因食管癌死亡的病人為40.02萬,其中我國為19.75萬,占到全球總數(shù)的49.35%。目前食管癌死亡率在我國惡性腫瘤中排名第4位。盡管近年來我們對(duì)于食管癌的認(rèn)識(shí)逐漸加深,從預(yù)防、診斷、治療等各方面有了長足的進(jìn)步,但是食管癌的總體情況是發(fā)現(xiàn)晚,治療遲,預(yù)后差,五年生存率徘徊在15%至25%之間。對(duì)于食管鱗癌的治療主要以內(nèi)鏡、手術(shù)、放化療等為主,其中術(shù)前以及術(shù)后的輔助化療是治療食管鱗癌的重要手段之一。而化療產(chǎn)生耐藥是影響治療效果和患者預(yù)后的主要問題所在。我們急需開發(fā)新的有效的藥物來治療食管鱗癌,同時(shí)對(duì)于目前臨床常用的化療藥物如順鉑等產(chǎn)生耐藥的機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究,以期克服耐藥,改善預(yù)后,為患者最終帶來獲益。既往關(guān)于化療耐藥的研究集中于腫瘤細(xì)胞本身,其可能的機(jī)制包括腫瘤細(xì)胞的基因突變,細(xì)胞膜表面藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等的改變,細(xì)胞對(duì)藥物代謝途徑的改變等。而近年來的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境在腫瘤耐藥中發(fā)揮了重要的作用,腫瘤微環(huán)境包括腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞等,其中CAF是腫瘤微環(huán)境中的主要組成部分之一,它在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、化療耐藥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,它可以被視為癌癥治療的潛在靶點(diǎn)。CAF主要通過細(xì)胞因子、細(xì)胞黏附以及影響免疫反應(yīng)等對(duì)腫瘤微環(huán)境進(jìn)行調(diào)節(jié),從而影響腫瘤細(xì)胞。在本研究中我們首先從食管鱗癌病人的腫瘤組織中原代分離培養(yǎng)CAF,使用免疫熒光方法鑒定CAF特異的標(biāo)記物。接下來我們使用共培養(yǎng)的方式發(fā)現(xiàn)順鉑預(yù)處理的CAF相比未處理的CAF可以促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖和產(chǎn)生耐藥。然后使用蛋白芯片,從順鉑預(yù)處理的CAF培養(yǎng)液上清中篩選出一種外分泌的細(xì)胞因子纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1),該細(xì)胞因子在CAF發(fā)生DNA損傷后分泌明顯增加。當(dāng)我們單獨(dú)使用細(xì)胞因子PAI-1時(shí),它可以通過旁分泌方式在體內(nèi)外促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖并減弱順鉑對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的殺傷作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)PAI-1可以通過激活A(yù)KT和ERK1/2信號(hào)通路,抑制caspase-3活性和ROS的增加來發(fā)揮作用。綜上所述,我們研究發(fā)現(xiàn)CAF在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和化療耐藥中發(fā)揮了重要的作用。順鉑刺激CAF后可以分泌大量的PAI-1,其通過旁分泌作用促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖、引起化療耐藥,它有可能成為食管癌鱗癌治療的新靶點(diǎn),使用PAI-1的抑制劑可以在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與順鉑一起發(fā)揮協(xié)同作用,值得進(jìn)一步地開發(fā)和研究。整個(gè)世界范圍內(nèi),食管癌的發(fā)病率和死亡率在全部惡性腫瘤中分別排名第8位和第6位。食管癌常見病理類型分為鱗癌和腺癌,其中我國以食管鱗癌為主,占總病例的90%以上。早期食管鱗癌缺乏特異性癥狀,盡管近年來在診斷、治療等各個(gè)方面有了長足的進(jìn)步,但是仍然缺乏有效的針對(duì)食管鱗癌的治療方法,目前主要的治療手段仍然是內(nèi)鏡、手術(shù)、放化療等,而食管鱗癌的總體生存率仍未有明顯改善,徘徊在15%至25%之間。因此,我們急需發(fā)現(xiàn)有效的治療食管鱗癌的藥物。植物提取物是抗癌藥物的重要來源之一,其中香茶菜屬(Isodon)植物是著名的有生物活性的二萜類,它具有多種多樣的骨架結(jié)構(gòu),尤其是對(duì)映-貝殼杉烷型二萜類。長管香茶菜甲素(LK-A)是一種從三葉香茶菜屬中分離得到的對(duì)映-貝殼杉烷型二萜類化合物,關(guān)于它的抗癌作用已經(jīng)在其他腫瘤中得到驗(yàn)證,包括鼻咽癌、肝細(xì)胞癌等。它可以通過引起腫瘤細(xì)胞DNA損傷、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,引起細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高等方式發(fā)揮抗癌作用。我們想要探討的問題包括LK-A在食管鱗癌中是否具有同樣的抗癌作用以及可能的機(jī)制,同時(shí)評(píng)估其未來的臨床應(yīng)用前景。經(jīng)過前期篩選我們發(fā)現(xiàn)LK-A對(duì)食管鱗癌細(xì)胞具有顯著抑制作用。我們通過CCK8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LK-A可以明顯抑制食管鱗癌細(xì)胞(KYSE30和KYSE450)增殖,同時(shí)對(duì)于非腫瘤正常細(xì)胞(NIH3T3和HEK293)的抑制作用明顯減弱,其中在食管鱗癌中LK-A的24小時(shí)IC50值分別為1.259μM和1.370μM,而在非腫瘤正常細(xì)胞中的IC50值分別為3.941μM和5.744μM。隨著LK-A劑量增加可以顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞平板克隆形成,引起食管鱗癌細(xì)胞G2/M期阻滯,降低細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinB1和cdc2表達(dá)水平。LK-A可以誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞凋亡,并呈時(shí)間、劑量依賴性,通過Westerm blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)LK-A可能通過Caspase依賴的線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞凋亡,同時(shí)使用Caspase抑制劑Z-VAD(OMe)-FMK預(yù)處理可以部分減弱LK-A誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。LK-A可以引起食管鱗癌細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)顯著增加,使用抗氧化劑N-乙醜半胱氨酸(NAC)可以減弱LK-A誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。LK-A可以激活JNK和p38 MAPK信號(hào)通路,使用JNK和p38 MAPK抑制劑可以減弱LK-A誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,同時(shí)NAC也可以減弱JNK和p38 MAPK磷酸化水平。最后,體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相比對(duì)照組,LK-A可以顯著抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤的大小、體積、重量等,同時(shí)LK-A對(duì)裸鼠的一般情況、體重?zé)o明顯影響,裸鼠肝腎組織的HE染色未見明顯毒副作用。這些結(jié)果在體內(nèi)證實(shí)LK-A是相對(duì)安全有效的抗癌藥物�？傊�,我們的研究發(fā)現(xiàn),LK-A可以在體內(nèi)外抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡,可以在食管鱗癌細(xì)胞中發(fā)揮新的抗腫瘤作用,同時(shí)具有一定的安全性。這表明該化合物可能具有作為臨床治療藥物的潛力,值得進(jìn)一步研究。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.1
【部分圖文】：

２、質(zhì)粒的小量提取??本研究中使用天根生物科技有限公司提供的質(zhì)粒小提中量試劑盒（ＴＩＡＮｐｒｅｐ??ＭｉｄｉＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ）。在使用前應(yīng)先在漂洗液ＰＷ中加入無水乙醇，并在瓶身上做好標(biāo)??記。具體操作步驟如下所示：??（１）柱平衡步驟：向吸附柱ＣＰ４（吸附柱放入收集管中）中加入５００Ｍ的平衡溶??液，在１２０００轉(zhuǎn)／分（１３４００ｇ）的條件下離心１分鐘，倒掉收集管中的廢液，??將吸附柱重新放回到收集管中。??（２）�。担恚爝^夜培養(yǎng)的菌液加入到離心管中，在１２０００轉(zhuǎn)／分（１３４００ｇ）的條件下??離心１分鐘，倒掉并盡量吸除上清液。??（３）向留有菌體沉淀的離心管中假如５００Ｍ的溶液Ｐ１，使用移液器或者漩渦振蕩??器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞的沉淀。??（４）向離心管中加入５００４的溶液Ｐ２，溫和的上下翻轉(zhuǎn)６－８次使菌體充分裂解。??（５）向離心管中加入７００Ｗ的溶液Ｐ３，立即溫和的上下翻轉(zhuǎn)６－８次，充分混勻，??此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，在１２０００轉(zhuǎn)／分（１３４００ｇ）的條件下離心１０分鐘，??此時(shí)在離心管底部形成沉淀，注意Ｐ３在加入之后應(yīng)當(dāng)立即混合，避免產(chǎn)生??

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文?實(shí)驗(yàn)方?表３標(biāo)準(zhǔn)品蛋白濃度與ＯＤ?５６２ｎｍ值的關(guān)系??標(biāo)準(zhǔn)品編號(hào)?標(biāo)準(zhǔn)品濃度（路／ｍｌ）?ＯＤ?５６２ｎｍ值??Ａ?２０００?１．０３１５??Ｂ?１５００?０．８１３８??Ｃ?１０００?０．５８６９??Ｄ?７５０?０．４９２４??Ｅ?５００?０．３７９２??Ｆ?２５０?０．２５２９??Ｇ?１２５?０．１６４２??Ｈ?２５?０．１２６８??Ｊ?０?０．０９８１???－

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)結(jié)果??一、食管鱗癌ＣＡＦ的分離、培養(yǎng)和鑒定??首先，如前所述［１４］，從食管鱗癌患者腫瘤組織中原代分們發(fā)現(xiàn)ＣＡＦ顯示出與腫瘤細(xì)胞形態(tài)不同的紡錘樣形態(tài)。我們使用ＣＡＦ特異標(biāo)志物對(duì)ＣＡＦ進(jìn)行了鑒定，包括用于區(qū)分成纖ａ－ＳＭＡ和ＥｐＣＡＭ。免疫熒光結(jié)果顯示ＣＡＦ可以被ａ－ＳＭＡＥｐＣＡＭ抗體染色（圖３Ａ和圖３Ｂ?）這也證實(shí)了我們分離培養(yǎng)出
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