研究背景:乳腺癌作為女性惡性腫瘤中最常見的也是最具威脅力的惡性腫瘤,統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)顯示其全球發(fā)病率僅次于第一位的肺癌。隨著研究的深入,其治療方式越來越趨于多樣化,常見的有手術(shù)治療、放疔、化療、內(nèi)分泌治療、中醫(yī)針灸等。然而臨床上仍然有1/3的女性經(jīng)過治療后發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。研究人員指出,許多涉及調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)歸的基因與蛋白都參與了對腫瘤干細(xì)胞調(diào)控。其中,miR-34a是與乳腺癌密切相關(guān)的小分子RNA之一,它在乳腺癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡等過程中均發(fā)揮了重要作用。MicroRNA-34a作為抑癌基因p53下游靶基因,它介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在腫瘤干細(xì)胞的自我更新中可能發(fā)揮重要作用,只有殺滅乳腺癌干細(xì)胞才能進(jìn)一步改善乳腺癌患者的預(yù)后。DLL1(Delta-like 1)蛋白作為Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Notch1受體的配體,是單次跨膜糖蛋白,屬于DSL(Delta,Serrate,Lag-2)蛋白。Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化最早始于Notch配體結(jié)合到Notch受體,二者結(jié)合后經(jīng)過一系列生化反應(yīng)活化Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,各種不同組織及其細(xì)胞的正常的或異常的生長發(fā)育分化活動都要受到該通路的調(diào)控。另有研究指出DLLl參與調(diào)控腫瘤的增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等過程。Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用非常廣泛,它不僅對胚胎及正常組織的生長發(fā)育至關(guān)重要,還是腫瘤干細(xì)胞中必不可少的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。新近研究表明:Notch信號的表達(dá)增強(qiáng)增加了腫瘤細(xì)胞的增殖能力,活化Notch信號可以起到維持腫瘤干細(xì)胞,誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等作用。Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游靶基因在該通路生物學(xué)特性的實現(xiàn)過程中扮演著重要角色,其中已知的靶基因包括:hey、cyclind1、hes、nrarp、p21、pre-tα、nf-κb等。目的:探討mir-34a對dll1蛋白的調(diào)控作用,以及mir-34a/dll1與notch信號通路和乳腺癌干細(xì)胞的作用,為乳腺癌的診斷和治療提供重要的理論和實驗依據(jù)。方法:1將乳腺癌細(xì)胞株mcf-7作為主要研究對象,采用免疫磁珠分選技術(shù)分選cd44+/cd24-乳腺癌干細(xì)胞,qrt-pcr,westernblot技術(shù)檢測分選出的干細(xì)胞中mir-34a和dll1蛋白表達(dá)趨勢。2.轉(zhuǎn)染mir-34a類似物和阻滯劑調(diào)節(jié)dll1蛋白在mcf-7細(xì)胞株中的表達(dá)情況。qrt-pcr和westernblot技術(shù)分別檢測mcf-7細(xì)胞內(nèi)dll1mrna和dll1蛋白的表達(dá)趨勢,westernblot進(jìn)一步探索notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游靶基因hey1蛋白的表達(dá)、乳腺癌干細(xì)胞重要標(biāo)記物aldh1表達(dá)以及凋亡相關(guān)的caspase3蛋白的表達(dá)情況,探討mir-34a/dll1蛋白對腫瘤及干細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。3.小rna分子干擾技術(shù)構(gòu)造dll1基因沉默的乳腺癌細(xì)胞系模型,通過qrt-pcr和westernblot技術(shù)相繼檢測轉(zhuǎn)染后的沉默效率,確定dll1基因被成功下調(diào),westernblot技術(shù)檢測hey1,caspase3及aldh1蛋白的表達(dá),進(jìn)一步證明mir-34a通過調(diào)控dll1蛋白實現(xiàn)其對notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及乳腺癌干細(xì)胞的調(diào)控。4.最后采用cck-8實驗和hochest33342染色驗證mir-34a/dll1對乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。結(jié)果:1.分選cd44+/cd24-乳腺癌干細(xì)胞后,檢測發(fā)現(xiàn)乳腺癌干細(xì)胞中的mir-34a趨于低表達(dá)狀態(tài),而dll1蛋白則趨于高表達(dá)。2.通過轉(zhuǎn)染實驗過表達(dá)/抑制mir-34a后,westernblot,qrt-pcr分別檢測dll1蛋白表達(dá)水以及基因表達(dá)水平;westernblot檢測hey1,caspase3,aldh1蛋白表達(dá),結(jié)果顯示過表達(dá)mir-34a從轉(zhuǎn)錄水平抑制了dll1蛋白表達(dá),hey1蛋白、aldh1與dll1蛋白表達(dá)水平正相關(guān),而caspase3表達(dá)水平與dll1蛋白負(fù)相關(guān)。3.小rna干擾技術(shù)敲低dll1基因表達(dá)后,westernblot方法檢測hey1,Caspase3,ALDH1蛋白表達(dá)與miR-34a mimics轉(zhuǎn)染后的表達(dá)水平一致。4.CCK-8法檢測DLL1蛋白對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響結(jié)果顯示:與對照組相比,下調(diào)DLL1蛋白抑制了MCF-7細(xì)胞增殖,上調(diào)DLL1蛋白對細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。Hochest33342染色結(jié)果表明下調(diào)DLL1蛋白后凋亡的細(xì)胞數(shù)增多。下調(diào)DLL1蛋白對細(xì)胞增殖的抑制作用可能是由于其誘導(dǎo)凋亡作用減少所致。結(jié)論:1.MiR-34a可通過下調(diào)DLL1蛋白表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。2.Dll1蛋白通過作用于Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,對乳腺癌細(xì)胞及乳腺癌干細(xì)胞的凋亡進(jìn)行調(diào)控。
【學(xué)位單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R737.9
【部分圖文】：

miR-34a在乳腺癌干細(xì)胞和非干細(xì)胞中的表達(dá)

圖 1-1 ALDH1 在干細(xì)胞和非干細(xì)胞中的表達(dá)術(shù)分選 CD44+/CD24- 乳腺癌干細(xì)胞,Western Bl 表達(dá)。細(xì)胞組 ALDH1 表達(dá)增多，提示本實驗成功分選出

圖 1-3 分選乳腺癌干細(xì)胞前后 DLL1 蛋白表達(dá)*：相比于對照組，p<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義本實驗組結(jié)果顯示：乳腺癌干細(xì)胞中 miR-34a 表達(dá)受到抑制，乳腺癌干細(xì)胞
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本文編號：2866184