發(fā)布時(shí)間：2020-11-01 15:58

　　 【研究背景】食管癌(carcinoma of esophagus)是世界上最常見的八大惡性腫瘤之一,好發(fā)于食管粘膜上皮或腺體,死亡率位居第六。盡管近幾年食管癌的手術(shù)和放化療等治療方法有較大進(jìn)展,但食管癌具有術(shù)后復(fù)發(fā)率高并且預(yù)后差的特點(diǎn)。食管癌的組織學(xué)類型主要為鱗狀細(xì)胞癌和腺癌,約占90%以上,在我國(guó)食管癌主要以鱗狀細(xì)胞癌為主。所以,目前針對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制及治療方法的探索一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。Micro RNA(mi RNA)分子是一種單鏈、非編碼的長(zhǎng)約17-25 nt小RNA分子,通過(guò)與靶基因的3-UTR區(qū)互補(bǔ)配對(duì)后對(duì)m RNA進(jìn)行切割或者翻譯抑制。Micro RNA分子在多種腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用,被認(rèn)為是一組新的致癌基因或抑癌基因。有研究表明micro RNA在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。如,在食管鱗狀細(xì)胞癌中mi R-21表達(dá)量增高并通過(guò)下調(diào)PTEN來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲性;而mi R-203和mi R-205表達(dá)量降低,并分別通過(guò)Np63和ZEB2通路抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖活性。因此micro RNA可以作為一種新的并行之有效的生物標(biāo)志物,對(duì)發(fā)現(xiàn)和研究食管鱗狀細(xì)胞癌新的發(fā)生和發(fā)展機(jī)理,尋找早期診斷和治療的新基因靶位具有重要意義�！狙芯磕康摹�1、分析mi R-1差異表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌的相互關(guān)系;2、觀察mi R-1對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,探討mi R-1在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生中的作用,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步研究�！痉椒ā�1、通過(guò)mi RNA基因芯片檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌組織同正常食管粘膜組織之間的mi RNA表達(dá)譜差異;2、通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證并篩選出目的分子mi R-1;3、擴(kuò)大樣本量,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR觀察mi R-1在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性;4、體外實(shí)驗(yàn)應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)mi R-1在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的表達(dá);5、將mi R-1的模擬物與抑制物及相應(yīng)對(duì)照分別轉(zhuǎn)染ECa109細(xì)胞和KYSE410細(xì)胞,通過(guò)MTT、平板克隆實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mi R-1的生物學(xué)功能;6、裸鼠皮下食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞注射成瘤,原位注射mi R-1激動(dòng)劑、激動(dòng)劑對(duì)照及生理鹽水,體內(nèi)觀察mi R-1的生物學(xué)功能;7、生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)mi R-1的靶基因并篩選出PREX1基因;8、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶基因PREX1同mi R-1的直接作用;9、應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中PREX1 m RNA的表達(dá)情況;10、ECa109細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染了mi R-1的模擬物及對(duì)照,Real-time PCR檢測(cè)PREX1的m RNA,Western blot檢測(cè)PREX1的蛋白表達(dá)變化;11、應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)PREX1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá),并分析與mi R-1表達(dá)的相關(guān)性�！窘Y(jié)果】1、對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌組織及正常食管粘膜組織的mi RNA表達(dá)譜統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示:將P0.05且表達(dá)差異大于2倍作為篩選標(biāo)準(zhǔn),獲得的mi RNA差異表達(dá)分子共43個(gè),包括27個(gè)在癌組織里低表達(dá)mi RNA和16個(gè)在癌組織中高表達(dá)mi RNA。表達(dá)差異倍數(shù)大于4倍的mi RNA分子共24個(gè),15個(gè)在癌組織中表達(dá)下調(diào)和9個(gè)在癌組織中表達(dá)上調(diào)。2、聚類分析結(jié)果顯示mi RNA表達(dá)譜在食管鱗狀細(xì)胞癌組織及正常食管粘膜上皮兩組內(nèi)分類明顯。9個(gè)差異表達(dá)mi RNA的實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)結(jié)果同其mi RNA芯片檢測(cè)結(jié)果一致,說(shuō)明芯片結(jié)果真實(shí)可靠,經(jīng)過(guò)綜合分析后選取mi R-1作為研究對(duì)象。3、實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)結(jié)果顯示mi R-1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)量下降明顯。90.6%(58/64)的患者食管鱗狀細(xì)胞癌組織中mi R-1的表達(dá)較正常組織下調(diào)超過(guò)50%(下調(diào)倍數(shù)大于2倍),并且統(tǒng)計(jì)分析顯示mi R-1的表達(dá)水平與食管鱗狀細(xì)胞癌腫瘤浸潤(rùn)深度及臨床分期顯著相關(guān)。4、mi R-1在5種ESCC細(xì)胞系中表達(dá)量都顯著降低,轉(zhuǎn)染上調(diào)mi R-1表達(dá)量后,ESCC腫瘤細(xì)胞增殖活性下降,克隆形成能力減弱,而抑制mi R-1的表達(dá),則使腫瘤細(xì)胞的增殖速度上升,克隆形成能力增強(qiáng)。同時(shí)提高mi R-1表達(dá)量可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力,降低mi R-1表達(dá)量,可顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)亦證明mi R-1能顯著抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。5、三個(gè)生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)得到共同的181個(gè)mi R-1下游靶基因,基因功能聚類分析發(fā)現(xiàn),這些mi R-1下游靶基因與轉(zhuǎn)錄因子活性、DNA特異性結(jié)合、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及血管生成等生命過(guò)程密切相關(guān)。6、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)mi R-1可顯著性抑制含有其結(jié)合位點(diǎn)的PREX1野生型質(zhì)粒熒光蛋白的表達(dá),但對(duì)于突變型和對(duì)照質(zhì)粒熒光蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響。7、實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)結(jié)果顯示mi R-1與PREX1在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染上調(diào)mi R-1表達(dá)量后PREX1的m RNA表達(dá)及蛋白表達(dá)水平均明顯下降。8、免疫組織化學(xué)染色顯示PREX1蛋白表達(dá)于細(xì)胞胞漿內(nèi),且食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于正常的食管粘膜組織,存在顯著性差異,并與mi R-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性�！窘Y(jié)論】mi R-1在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)明顯下調(diào)并且能夠抑制腫瘤的增殖、遷移及侵襲,其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制其靶基因PREX1表達(dá),進(jìn)而可能通過(guò)Rac通路在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。本研究為食管鱗狀細(xì)胞癌的診斷及個(gè)體化治療新的潛在分子標(biāo)志物奠定理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R735.1
【文章目錄】：
縮略語(yǔ)表
中文摘要
ABSTRACT
前言
文獻(xiàn)回顧
    1.食管癌概述
        1.1 食管癌流行病學(xué)概況
        1.2 食管癌發(fā)生的病因?qū)W
        1.3 食管癌的治療措施與預(yù)后
    2. mi RNA與食管癌
        2.1 miRNA簡(jiǎn)介
        2.2 食管癌相關(guān)促腫瘤性miRNA
        2.3 食管癌相關(guān)腫瘤抑制性miRNA
        2.4 miRNA在食管癌診斷及治療中的作用
    3. miR-1 與腫瘤
        3.1 miR-1 基因概述
        3.2 miR-1 的生物學(xué)功能
        3.3 miR-1 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用
    4. PREX1基因與腫瘤
        4.1 PREX1基因概述
        4.2 PREX1基因表達(dá)特征
        4.3 PREX1基因生理功能
        4.4 PREX1基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用
實(shí)驗(yàn)一 食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生相關(guān)miRNA的篩選及鑒定
    1.材料
        1.1 組織樣本收集
        1.2 miRNA芯片
        1.3 miRNA的引物合成
        1.4 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.5 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.方法
        2.1 食管鱗狀細(xì)胞癌miRNA表達(dá)譜的檢測(cè)
        2.2 實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)部分miRNA差異表達(dá)水平的檢測(cè)
        2.3 芯片檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3.結(jié)果
        3.1 食管鱗狀細(xì)胞癌組織miRNA表達(dá)譜檢測(cè)結(jié)果
        3.2 miRNA基因芯片檢測(cè)結(jié)果的聚類分析
        3.3 實(shí)時(shí)定量熒光PCR驗(yàn)證部分miRNA差異表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果
    4.討論
實(shí)驗(yàn)二 miR-1 對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的實(shí)驗(yàn)研究
    1.材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的選擇與收集
        1.2 細(xì)胞株
        1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.4 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.方法
        2.1 組織標(biāo)本miRNA差異表達(dá)水平的檢測(cè)
        2.2 細(xì)胞株mi RNA差異表達(dá)水平的檢測(cè)
        2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的篩選
        2.4 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
        2.5 平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)
        2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)
        2.7 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)
        2.8 裸鼠體內(nèi)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
    3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 miR-1 在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性
        3.2 miR-1 在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)
        3.3 miR-1 對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響
        3.4 miR-1 對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響
        3.5 miR-1 對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響
    4.討論
實(shí)驗(yàn)三 miR-1 靶向PREX1基因的初步研究
    1.材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.方法
        2.1 miR-1 靶基因生物信息學(xué)分析
        2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
        2.3 PREX1 mRNA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
        2.4 PREX1蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
        2.5 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)
    3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 miR-1 靶向基因分析預(yù)測(cè)結(jié)果
        3.2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證miR-1 靶向PREX1基因的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3 miR-1 與PREX1在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的表達(dá)
        3.4 miR-1 抑制PREX1的mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)
        3.5 PREX1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)
    4.討論
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果
致謝

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊磊;王少康;孫桂菊;胡旭;開海濤;楊立剛;蘇明;崔永生;王加生;;食管癌危險(xiǎn)因素的病例對(duì)照研究[J];腫瘤;2009年03期

本文編號(hào)：2865763