【研究背景】食管癌(carcinoma of esophagus)是世界上最常見的八大惡性腫瘤之一,好發(fā)于食管粘膜上皮或腺體,死亡率位居第六。盡管近幾年食管癌的手術和放化療等治療方法有較大進展,但食管癌具有術后復發(fā)率高并且預后差的特點。食管癌的組織學類型主要為鱗狀細胞癌和腺癌,約占90%以上,在我國食管癌主要以鱗狀細胞癌為主。所以,目前針對食管鱗狀細胞癌發(fā)病機制及治療方法的探索一直是研究的熱點和難點。Micro RNA(mi RNA)分子是一種單鏈、非編碼的長約17-25 nt小RNA分子,通過與靶基因的3-UTR區(qū)互補配對后對m RNA進行切割或者翻譯抑制。Micro RNA分子在多種腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著關鍵性的作用,被認為是一組新的致癌基因或抑癌基因。有研究表明micro RNA在食管鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。如,在食管鱗狀細胞癌中mi R-21表達量增高并通過下調(diào)PTEN來調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖和侵襲性;而mi R-203和mi R-205表達量降低,并分別通過Np63和ZEB2通路抑制食管鱗狀細胞癌細胞的增殖活性。因此micro RNA可以作為一種新的并行之有效的生物標志物,對發(fā)現(xiàn)和研究食管鱗狀細胞癌新的發(fā)生和發(fā)展機理,尋找早期診斷和治療的新基因靶位具有重要意義�！狙芯磕康摹�1、分析mi R-1差異表達與食管鱗狀細胞癌的相互關系;2、觀察mi R-1對食管鱗狀細胞癌細胞生物學功能的影響,探討mi R-1在食管鱗狀細胞癌發(fā)生中的作用,并對其作用機制進行初步研究�！痉椒ā�1、通過mi RNA基因芯片檢測食管鱗狀細胞癌組織同正常食管粘膜組織之間的mi RNA表達譜差異;2、通過實時定量PCR對芯片結果進行驗證并篩選出目的分子mi R-1;3、擴大樣本量,應用實時定量PCR觀察mi R-1在食管鱗狀細胞癌中的表達及其與臨床病理特征的相關性;4、體外實驗應用實時定量PCR技術檢測mi R-1在食管鱗狀細胞癌細胞系中的表達;5、將mi R-1的模擬物與抑制物及相應對照分別轉染ECa109細胞和KYSE410細胞,通過MTT、平板克隆實驗、劃痕實驗及Transwell侵襲實驗檢測mi R-1的生物學功能;6、裸鼠皮下食管鱗狀細胞癌細胞注射成瘤,原位注射mi R-1激動劑、激動劑對照及生理鹽水,體內(nèi)觀察mi R-1的生物學功能;7、生物信息學軟件預測mi R-1的靶基因并篩選出PREX1基因;8、雙熒光素酶報告基因實驗驗證靶基因PREX1同mi R-1的直接作用;9、應用實時熒光PCR檢測食管鱗狀細胞癌細胞系中PREX1 m RNA的表達情況;10、ECa109細胞系中轉染了mi R-1的模擬物及對照,Real-time PCR檢測PREX1的m RNA,Western blot檢測PREX1的蛋白表達變化;11、應用免疫組織化學染色檢測PREX1在食管鱗狀細胞癌組織中的表達,并分析與mi R-1表達的相關性�！窘Y果】1、對食管鱗狀細胞癌組織及正常食管粘膜組織的mi RNA表達譜統(tǒng)計分析結果顯示:將P0.05且表達差異大于2倍作為篩選標準,獲得的mi RNA差異表達分子共43個,包括27個在癌組織里低表達mi RNA和16個在癌組織中高表達mi RNA。表達差異倍數(shù)大于4倍的mi RNA分子共24個,15個在癌組織中表達下調(diào)和9個在癌組織中表達上調(diào)。2、聚類分析結果顯示mi RNA表達譜在食管鱗狀細胞癌組織及正常食管粘膜上皮兩組內(nèi)分類明顯。9個差異表達mi RNA的實時定量熒光PCR檢測結果同其mi RNA芯片檢測結果一致,說明芯片結果真實可靠,經(jīng)過綜合分析后選取mi R-1作為研究對象。3、實時定量熒光PCR檢測結果顯示mi R-1在食管鱗狀細胞癌組織中表達量下降明顯。90.6%(58/64)的患者食管鱗狀細胞癌組織中mi R-1的表達較正常組織下調(diào)超過50%(下調(diào)倍數(shù)大于2倍),并且統(tǒng)計分析顯示mi R-1的表達水平與食管鱗狀細胞癌腫瘤浸潤深度及臨床分期顯著相關。4、mi R-1在5種ESCC細胞系中表達量都顯著降低,轉染上調(diào)mi R-1表達量后,ESCC腫瘤細胞增殖活性下降,克隆形成能力減弱,而抑制mi R-1的表達,則使腫瘤細胞的增殖速度上升,克隆形成能力增強。同時提高mi R-1表達量可以抑制腫瘤細胞的遷移及侵襲能力,降低mi R-1表達量,可顯著增強腫瘤細胞的遷移及侵襲能力。體內(nèi)實驗亦證明mi R-1能顯著抑制食管鱗狀細胞癌細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。5、三個生物學軟件預測得到共同的181個mi R-1下游靶基因,基因功能聚類分析發(fā)現(xiàn),這些mi R-1下游靶基因與轉錄因子活性、DNA特異性結合、信號傳導、轉錄調(diào)節(jié)及血管生成等生命過程密切相關。6、雙熒光素酶報告基因實驗發(fā)現(xiàn)mi R-1可顯著性抑制含有其結合位點的PREX1野生型質粒熒光蛋白的表達,但對于突變型和對照質粒熒光蛋白的表達無明顯影響。7、實時定量熒光PCR檢測結果顯示mi R-1與PREX1在食管鱗狀細胞癌細胞系中的表達呈負相關關系。與對照組相比,轉染上調(diào)mi R-1表達量后PREX1的m RNA表達及蛋白表達水平均明顯下降。8、免疫組織化學染色顯示PREX1蛋白表達于細胞胞漿內(nèi),且食管鱗狀細胞癌組織中的表達明顯高于正常的食管粘膜組織,存在顯著性差異,并與mi R-1表達呈負相關性�！窘Y論】mi R-1在食管鱗狀細胞癌中表達明顯下調(diào)并且能夠抑制腫瘤的增殖、遷移及侵襲,其作用機制可能是通過抑制其靶基因PREX1表達,進而可能通過Rac通路在食管鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。本研究為食管鱗狀細胞癌的診斷及個體化治療新的潛在分子標志物奠定理論基礎。
【學位單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R735.1
【文章目錄】：
縮略語表
中文摘要
ABSTRACT
前言
文獻回顧
    1.食管癌概述
        1.1 食管癌流行病學概況
        1.2 食管癌發(fā)生的病因學
        1.3 食管癌的治療措施與預后
    2. mi RNA與食管癌
        2.1 miRNA簡介
        2.2 食管癌相關促腫瘤性miRNA
        2.3 食管癌相關腫瘤抑制性miRNA
        2.4 miRNA在食管癌診斷及治療中的作用
    3. miR-1 與腫瘤
        3.1 miR-1 基因概述
        3.2 miR-1 的生物學功能
        3.3 miR-1 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用
    4. PREX1基因與腫瘤
        4.1 PREX1基因概述
        4.2 PREX1基因表達特征
        4.3 PREX1基因生理功能
        4.4 PREX1基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用
實驗一 食管鱗狀細胞癌發(fā)生相關miRNA的篩選及鑒定
    1.材料
        1.1 組織樣本收集
        1.2 miRNA芯片
        1.3 miRNA的引物合成
        1.4 實驗試劑
        1.5 實驗儀器
    2.方法
        2.1 食管鱗狀細胞癌miRNA表達譜的檢測
        2.2 實時定量PCR對部分miRNA差異表達水平的檢測
        2.3 芯片檢測結果的統(tǒng)計學分析
    3.結果
        3.1 食管鱗狀細胞癌組織miRNA表達譜檢測結果
        3.2 miRNA基因芯片檢測結果的聚類分析
        3.3 實時定量熒光PCR驗證部分miRNA差異表達水平的檢測結果
    4.討論
實驗二 miR-1 對食管鱗狀細胞癌細胞生物學行為影響的實驗研究
    1.材料
        1.1 實驗標本的選擇與收集
        1.2 細胞株
        1.3 實驗試劑
        1.4 實驗儀器
    2.方法
        2.1 組織標本miRNA差異表達水平的檢測
        2.2 細胞株mi RNA差異表達水平的檢測
        2.3 細胞轉染條件的篩選
        2.4 MTT細胞增殖實驗
        2.5 平板細胞克隆形成實驗
        2.6 細胞劃痕實驗
        2.7 Transwell侵襲實驗
        2.8 裸鼠體內(nèi)細胞增殖實驗
    3.實驗結果
        3.1 miR-1 在食管鱗狀細胞癌組織中的表達與臨床病理特征的相關性
        3.2 miR-1 在食管鱗狀細胞癌細胞系中的差異表達
        3.3 miR-1 對食管鱗狀細胞癌細胞增殖的影響
        3.4 miR-1 對食管鱗狀細胞癌細胞遷移及侵襲能力的影響
        3.5 miR-1 對食管鱗狀細胞癌細胞體內(nèi)成瘤能力的影響
    4.討論
實驗三 miR-1 靶向PREX1基因的初步研究
    1.材料
        1.1 實驗試劑
        1.2 實驗儀器
    2.方法
        2.1 miR-1 靶基因生物信息學分析
        2.2 雙熒光素酶報告基因檢測實驗
        2.3 PREX1 mRNA檢測實驗
        2.4 PREX1蛋白檢測實驗
        2.5 免疫組織化學實驗
    3.實驗結果
        3.1 miR-1 靶向基因分析預測結果
        3.2 雙熒光素酶報告基因檢測驗證miR-1 靶向PREX1基因的實驗結果
        3.3 miR-1 與PREX1在食管鱗狀細胞癌細胞系中的表達
        3.4 miR-1 抑制PREX1的mRNA表達及蛋白表達
        3.5 PREX1在食管鱗狀細胞癌組織中的表達
    4.討論
小結
參考文獻
個人簡歷和研究成果
致謝

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 楊磊;王少康;孫桂菊;胡旭;開海濤;楊立剛;蘇明;崔永生;王加生;;食管癌危險因素的病例對照研究[J];腫瘤;2009年03期

本文編號：2865763