結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是發(fā)生在人體下消化道的一種癌癥,包括結腸癌和直腸癌。CRC的發(fā)病率在全球范圍內高居不下,居癌癥發(fā)病率的第三位。在我國,隨著生活水平的提高以及生活習慣的西化,結直腸癌的發(fā)病率也在逐年遞增。傳統(tǒng)的手術治療輔以化學藥物治療和放射線治療,對患者的毒副作用大,雖然提高了五年生存率,但是嚴重影響患者的生活質量;靶向治療的方法存在天然或獲得性耐藥;免疫治療可能會并含某些不可預知的并發(fā)癥;而基因治療存在導入率低、成本高等問題,所以尋找一種安全可靠毒副作用小的治療方式成為主要研究方向。益生菌是一類寄居在人體腸道和生殖系統(tǒng)內的活的微生物,對人體健康有益。乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是益生菌的主要成員,且在近年研究中發(fā)現乳酸菌不僅具有改善物質風味,天然防腐抑菌等功能,還能維持宿主體內的微生態(tài)平衡,保護宿主腸道健康;刺激宿主免疫,預防宿主癌癥的發(fā)生。所以使用益生菌進行預防或輔助治療CRC可能正是我們所尋求的安全可靠毒副作用小的治療方式之一。本研究主要從云南傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到的乳酸菌,并挑選10株菌進行抑制結直腸癌細胞HT-29增殖功能的篩選。益生菌的代謝產物(即發(fā)酵上清)制成凍干粉溶液后,用于處理HT-29細胞,并用MTT的方法檢測細胞活力,計算細胞存活率,用于評估乳酸菌的抗增殖能力,最后篩選出兩株具有良好抑制效果的菌株。使用其它結直腸癌細胞系對這兩株菌進一步篩選;篩選出來的乳酸菌處理HT-29細胞后,使用流式細胞儀檢測處理后細胞的細胞周期和凋亡情況,最后挑選出一株抗增殖效果最好的乳酸菌,并對其抗HT-29細胞增殖的機理進行深入研究。轉錄組學的方法從分子水平上能夠了解HT-29細胞基因表達的整體情況,并預測其抗增殖作用的分子機理。主要研究內容和實驗結果如下:1.從實驗室自主分離保存的菌種中挑選10株用于實驗,分別是Lactobacillus fermentum JSL8-2(發(fā)酵乳桿菌JSL8-2)、Pediococcus pentosus 2-4L(戊糖片球菌2-4L)、Lactobacillus plantarum AY01、QB3-1、QB3-3、YM4-3(植物乳桿菌AY01、QB3-1、QB3-3、YM4-3)、Lactococcus latics BZ06(乳酸乳球菌BZ06)、Lactobacillus casei AS02(干酪乳桿菌AS02)、Lactobacillus brevis 3M(短乳桿菌3M)、Lactobacillus curvatus 6M(彎曲乳桿菌6M),乳酸菌的發(fā)酵上清制成凍干粉,使用細胞培養(yǎng)基重懸成溶液后,稀釋成不同濃度處理HT-29細胞,MTT方法檢測細胞活力,最后篩選出兩株具有良好抗增殖效果的菌株AY01和JSL8-2。2.不同濃度的AY01和JSL8-2處理HT-29細胞后,結果顯示,隨著凍干粉溶液濃度的增加,菌株的抗增殖效果越好,且在64 mg/mL和128 mg/mL的濃度下,抑制效果最好。此外,隨著處理時間的增加,抗增殖效果也越好,且在48 h和60 h時抑制效果達到最佳,但在這兩個時間點上,抑制效果沒有明顯差異3.分別用不同濃度的AY01和JSL8-2的凍干粉溶液處理CRC細胞株Caco-2、HCT116、SW620,用MTT法檢測細胞活力,AY01和JSL8-2對其它CRC細胞株也具有抗增殖的作用,且在濃度為64 mg/mL和128 mg/mL時效果最好,培養(yǎng)時間達到48 h和60 h時抑制效果也最好。4.使用流式細胞儀檢測AY01和JSL8-2處理HT-29細胞后的細胞周期和凋亡情況,從細胞水平上評估這兩株菌的抗增殖能力。研究發(fā)現,AY01和JSL8-2都是通過誘導細胞凋亡實現抗增殖作用的,而不是通過阻滯細胞周期;此外,我們發(fā)現,AY01的誘導凋亡能力較JSL8-2的更強,所以最終選定的菌株為AY01。5.根據流式細胞儀的檢測結果,32 mg/mL的AY01凍干粉溶液處理HT-29細胞,使用轉錄組學的方式探究細胞內的基因表達情況,結果顯示,與細胞凋亡相關的基因表達差異較大,正好與流式細胞儀的結果相一致。6.轉錄組數據分析顯示,AY01作用于HT-29細胞,主要是通過兩條信號通路,TGF-β/smad信號通路和Ferroptosis死亡途徑,實現細胞周期的阻滯、誘導細胞凋亡、細胞自噬以及Ferroptosis死亡。
【學位單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.34
【部分圖文】：

圖 1 CRC 發(fā)生及發(fā)展示意圖.2.1 CRC 的發(fā)生與腸道微生物腸道微生物是指集聚人體或動物體結腸、直腸等下消化道內的微生物。人類的腸道中集著大量的微生物，占人體總微生物量的 78%，其數量高達 1014cfu，大約是人體真核細的 10 倍。隨著科學研究的深入，科學家們發(fā)現腸道微生物在人類健康方面發(fā)揮著重要用，尤以腸道相關疾病最甚，包括炎癥性腸�。↖nflammatory Bowel Disease, IBD）、潰瘍結腸炎（Ulcreative colitis, UC）、CRC 等等。近年，許多研究均證實，與對照相比，CRC 患者的腸道群落結構發(fā)生改變，其中與RC 發(fā)生相關的促炎機會致病菌顯著增多，如具核梭桿菌屬、腸球菌科和彎曲桿菌屬等[7, 8]。于此，Tjalsma 等[9]提出腸道菌群致癌的“Driver-Passenger”模型：某些特定的腸道固有菌過誘導腸上皮細胞染色體不穩(wěn)定、免疫炎癥反應參與腫瘤的早期形成，這些腸道固有細被定義為 “drivers” 菌；其次，癌變過程介導了腸道微環(huán)境的改變，drivers 菌慢慢被其

圖 2 CRC 細胞凋亡機制.3 飲食、生活習慣等因素導致 CRC 的發(fā)生結直腸癌的發(fā)生很大程度上還受食物和營養(yǎng)因素的影響。據統(tǒng)計，30%～50%的結直癌患者有不當膳食結構和營養(yǎng)因素[17]。研究認為，高熱量、高飽和脂肪酸和高膽固醇膳，以及食用富含亞硝胺的食品可能與結直腸癌的發(fā)生有關，而高膳食纖維、高維生素、葉酸膳食可能是結直腸癌的保護因素[18]。除了飲食，以下風險因素（其中經常共同發(fā)生交互）已經被識別和建立在流行病學上的研究：家族史的結腸直腸癌，炎癥性腸病，吸，過度飲酒，肥胖和糖尿病（表 2）[19]。表 2 結直腸癌的風險與預防因素的概述[19]因素 風險社會人口因素年齡 ↑↑↑

圖 2.2 5-FU 對 HT-29 細胞生長的抑制作用（48 h）同濃度下的凍干粉溶液對 HT-29 細胞的影響10株菌同時進行篩選，采用從高濃度到低濃度的凍干粉溶液對 HT-29細胞生長曲線。本實驗的使用濃度依次為 250 mg/ mL、125 mg/ mL、10 mg/ mL、5L，在 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、96 h 處測定 OD 值，用 O
【參考文獻】

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1 宋美璇;李顯蓉;;結直腸癌的發(fā)生與飲食構成因素關系的研究進展[J];中國普外基礎與臨床雜志;2015年09期

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3 李衛(wèi)芬;文靜;吳紅照;翟玲;余東游;;枯草芽孢桿菌對肉雞生長性能和腸黏膜抗氧化及免疫功能的影響[J];中國畜牧雜志;2011年09期

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本文編號：2865646